2.

2. 상동성 검색 (homology search)

1. 실험목표
지난 반세기 동안 많은 단백질과 유전자 서열에 대한 정보가 축적되었다. 특히 최근 10여년간 집중적으로 이루어진 게놈분석을 통해 사람을 비롯한 많은 생물체들의 유전정보가 밝혀졌다. 이와 같이 기존에 알려진 유전자나 단백질 서열정보의 데이터베이스에서 유사한 서열을 검색하는 작업을 상동성 검색이라고 한다. 이러한 검색을 통해 얻어지는 이미 확인된 서열들과의 유사성은 다양한 정보를 제공한다. 상동성 검색은 유사성 검색 (similarity search)이라는 말과 혼용하여 사용하기도 한다. 일반적으로 DNA보다는 단백질 서열에 대한 상동성 분석에 유용하게 이용된다.

이 실험에서는 지난 주에 얻어진 단백질 서열을 가지고 상동성 검색을 실시하여 어떤 단백질인지를 확인하는 과정에 대하여 배운다. 이 실험에서는 이미 알려진 서열이 주어졌기 때문에 당연히 이와 동일한 서열의 단백질이 찾아짐으로써 어떤 단백질의 서열인지 쉽게 알아낼 수 있다. 만약 지금까지 알려지지 않은 새로운 단백질의 경우라도 기존에 알려진 단백질 서열과의 유사성을 통해 그 단백질의 기능을 유추할 수 있다. 단백질의 일차구조는 삼차원구조를 결정하기 때문에 같은 활성 또는 기능을 가지는 단백질들은 서열상의 유사성을 가진다. 서열상의 유사성이란 전체 서열의 길이가 비슷하고 그 아미노산 잔기들의 유사성이 10% 이상인 경우에 해당하며, 이러한 단백질들은 상동 단백질 (homologous protein 또는 homolog)이라 불린다.

2. 실험내용
지난 시간에 얻어진 단백질 서열을 가지고 상동성 분석과 다중배열을 실시한다.
상동성 분석에서는 NCBI 웹에서 Blast search 요령을 배운다. 데이터베이스를 검색하는데 어떤 프로그램을 사용할 것인가에 대해서는 논쟁의 여지가 많으며 새롭게 개발된 프로그램들이 계속 나오고 있기 때문에 선택하는데 어려움이 많다. 사용할 프로그램을 선택한 후에도 프로그램의 파라미터 값들을 다시 선택해야 하고 검색 결과도 해석할 수 있어야 한다. 이러한 문제들을 극복하기 위해서 상동성 검색의 프로그램 원리와 종류의 기본적인 지식을 가지는 것이 필요하지만 여기서는 NCBI에서 제공하는 Blast search를 중심으로 기본적인 내용만 다루도록 하겠다. (보다 자세히 알고 싶은 사람은 추가자료를 읽어보기 바란다).
Blast search: Sequence alignments provide a powerful way to compare novel sequences with previously characterized genes. Both functional and evolutionary information can be inferred from well designed queries and alignments. BLAST 2.0, (Basic Local Alignment Search Tool), provides a method for rapid searching of nucleotide and protein databases. Since the BLAST algorithm detects local as well as global alignments, regions of similarity embedded in otherwise unrelated proteins can be detected. Both types of similarity may provide important clues to the function of uncharacterized proteins.

   검색 요령
   (1) 상동성 검색 시 query 서열로 사용할 수 있는 것은 염기나 아미노산 서열이다. 즉, DNA나 단백질 서열이다. Query 서열은 반드시 지난 시간에 보여준 Fasta form으로 주어져야만 한다.
   (2) DNA나 단백질 서열은 각기 다른 목적으로 사용된다. 상동성 검색에 주로 사용되는 것은 단백질 서열이고, DNA 서열은 동일한 서열이나 밀접하게 연관된 것들을 찾는데 유용하다.
   (3) 사용되는 데이터베이스에는 여러 가지가 있고 계속 증가한다. 다양한 분석을 하기 위해서는 이들에 대하여 알고 있어야 하지만 기본적으로는 nucleotide database 인 nr과 protein database인 pdb 또는 swissprot 이 이용된다. 어떤 database를 선택하느냐에 따라 얻어지는 자료의 양과 그에 따른 소요시간이 달라진다.

기본적인 사용원칙은 다음 표와 같다.

표 1. BLAST에서 가능한 검색들^a
program	query	database	comparison	common use
blastn nucleotide blast	DNA	DNA	DNA level	Seek identical DNA sequences and splicing patterns
blastp protein blast	protein	protein	protein level	Find homologous proteins
blastx	DNA	protein	protein level	Analyze new DNA to find genes and seek homologous proteins
tblastn	protein	DNA	protein level	Search for genes in unannotated DNA
tblastx	DNA	DNA	protein level	Discover gene structure
^a FASTA에서도 유사한 검색이 이루어진다.

(4) NCBI에서 제공하는 Blast search에서는 기본적인 설정값이 사용되지만, 여러 가지 변수들을 임의로 입력할 수도 있다. 다만 입력값에 대한 원칙은 없으며, 시행착오를 통해 보다 유용한 결과를 얻을 수도 있다. Blast의 사용요령은 NCBI 웹에서도 배울 수 있다; BLAST Tutorial. 또한 기본적인 의문사항에 대해서는 별도의 설명도 주어져 있다: Frequently asked questions. 몇가지 기본적인 점에 대해서는 추가자료2 를 읽어보기 바란다.

   검색과정: NCBI에서의 검색요령을 단계별로 기술하였다.
   (1) 오른편 창에서 BLAST를 클릭한다.
   (2) Basic BLAST 하단에 있는 protein blast를 클릭한다.
   (3) Enter Query Sequence 창에 지난 시간에 얻어진 단백질 서열을 카피하여 넣는다.
   (4) Choose Search Set 창의 Database에 Non-redundant protein sequence (nr)이 보일 것이다. 이것을 다른 것으로 바꿀 수도 있지만 주어진대로 사용한다.
   (5) 하단에 BLAST를 클릭한다.
   (6) 잠시 후 창이 바뀌면서 결과 (Graphic Summary, Descriptions, Alignments)를 보여준다.
   (7) Descriptions에서 첫 번째 서열에 주목하라. E value가 0.0이라면 동일한 서열을 의미한다. (0의 값은 무작위적으로 찾아질 가능성이 없음을 의미한다)
   (8) 더 아래로 내려가면 찾아진 서열에 대한 정보와 더불어 입력한 서열 (Query)과 찾아진 서열 (Sbjct)의 배열결과를 보여준다. 100% 일치하는 서열인지 확인하고, 이 서열이 어떤 생물체의 어떤 단백질에 대한 것인지 기록한다.
   (9) 아래로 내려갈수록 유사성이 떨어지는 단백질 서열들을 보여줄 것이다. 일치하는 첫 번째 서열과 더불어 이들 중 5가지의 서열을 골라서 가장 왼편에 보여주는 박스를 체크한다.
   (10) 윈도우 창의 제일 하단으로 이동하면 Get selected sequences가 보일 것이다. 이것을 클릭하면 새로운 결과 창이 열린다. 이들 각각에서 FASTA를 클릭하면 FASTA format의 서열을 보여준다. 또는 앞부분의 박스를 체크한 후 Disaplay Settingd에서 FASTA를 클릭하면 한꺼번에 보여준다.
   (11) 각각의 FASTA format을 메모장에서 하나의 txt 파일로 저장한다. 이때 > 뒤의 이름을 10자 이내의 간략한 이름으로 바꾸는 것이 좋다. 다중배열에서 허용되는 글자수에 제한이 있기 때문이다. 각각의 서열에 대해서는 어떤 생물체의 것인지 별도로 기록해둔다.

FASTA format의 예 (대소문자는 상관없음)
>Droso
MRHIILITGAGKGIGKAIALEFA------------------------
>Human
MKHILLITGAGKGIGRAIALEFA-----------------------
>Mouse
KVLAIVTGASKGFGKAIAQEIVK-----------------------

상동성 분석을 통해 얻어진 단백질 서열을 가지고 GenomeNet 웹에서 다중배열을 실시한다. Blast 검색에서는 query 서열과 유사성을 가진 서열 간의 관계 만을 보여준다. 소위 짝배열 (pairwiase alignment) 만을 보여주는 것이다. 다중배열이란 2개 이상의 단백질 또는 핵산 서열들의 유사성을 비교하여 배열하는 것을 가리킨다. 이 방법은 Blast 검색을 통해 얻어진 많은 유사서열들을 서로 비교함으로써 어떤 연관이 있는지를 알 수 있게 해준다. 다중배열에 가장 많이 사용되는 프로그램은 ClustalW이다. 이것은 웹사이트를 통해 수행할 수도 있고, 프로그램을 다운받아 개인 컴퓨터에서도 사용할 수 있다. ClustalW에서는 우선 모든 서열들을 두 개씩 배열하는 짝배열을 실시하고, 그 결과를 토대로 dendrogram을 구성한다. 이것을 토대로 최종적으로 다중배열을 실시하여 그 결과를 보여준다.
이 실험에서는 일본 GenomeNet에서 제공하는 ClustalW를 사용하여 다중배열을 실시하는 요령에 대하여 배운다. GenomeNet Bioinformatics Tools에서 CLUSTALW를 클릭하면 원하는 화면이 열린다. 주어진 창에 FASTA format의 서열을 모두 복사하여 붙여넣은다. DNA 인지 protein 인지를 구분해야하지만 단백질 서열의 경우 설정값들을 그대로 사용하여도 무방하다. Execute multiple alignment를 누르면 잠시후 결과를 보여준다. 각 서열간의 상동성의 정도를 %값으로 알 수 있으며, 배열된 배열된 결과를 4가지 등급의 표시로 보여준다. 결과보기

자신의 PC에 ClustalW를 설치하여 여러 가지 조건들을 변화시키면서 프로그램을 돌릴 수도 있다. 관심이 있는 사람은 독자적으로 해볼 수 있도록 사용 요령을 기술해놓았다. 또한 다중배열 결과를 Genedoc 프로그램을 이용하여 볼 수도 있다. ClustalW와 Genedoc 사용요령

3. 과제물

(1) 다음과 같은 표를 작성한다.

서열명	단백질명	아미노산 잔기수	유사성 (%)	생물종	생물종의 특성

(2) 다중배열 결과를 그림으로 카피하여 첨부한다. (Print Screen을 통해 배열된 부분만 그림으로 저장)