데이터베이스 검색 (database search)을 종종 상동성 검색 (homology search)과 유사성 검색 (similarity search)이라는 말과 섞어서 사용한다. 상동성은 두개의 서열이 공통된 진화적 관계에 있다는 것을 뜻한다. 아미노산 서열이나 염기 서열이 부분적으로 일치하거나 전체적으로 높은 유사성을 가진다고 해서 항상 공통된 시조 (ancester) 서열에서 진화했다는 것을 직접적으로 뜻하는 것은 아니기 때문에 데이터베이스 검색을 유사성 검색이라는 말로 통일해 사용하겠다.
데이터베이스를 검색하는데 어떤 프로그램을 사용할 것인가에 대해서는 논쟁의 여지가 많으며 새롭게 개발된 프로그램들이 계속 나오고 있기 때문에 선택하는데 어려움이 많다. 사용할 프로그램을 선택한 후에도 프로그램의 파라미터 값들을 다시 선택해야 하고 검색 결과도 해석할 수 있어야 한다. 이러한 문제들을 극복하기 위해서 유사성 검색의 프로그램 원리와 종류의 기본적인 지식을 가지는 것이 필요하다.
유사성 검색을 통해 데이터베이스에서 유사성 있는 서열들을
찾고자 입력하는 서열을 query 서열이라고 한다.
Query 서열로 데이터베이스를 검색해 보면 서열간의 유사성은 낮지만 관련성이
있는 유전자들이 검색되지 않는 경우
(false negatives)가 있는 반면
유사성이 높아 검색 결과에 포함되지만 실제 생물학적인 의미는 없는 서열들 (false positives)도 있다. 따라서 유사성 검색은 진화적으로 관계가 있는 서열들을 찾을 수 있는 sensitivity와
우연히 유사성을 가지는 서열들은 검색 결과에서 제외될 수 있는 selectivity에
대한 적절한 절충점을 가져야 할 것이며
sensitivity를 높였을 때의
검색 시간도 고려해야 한다.
유사성 검색 시
query 서열로 사용할 수 있는
것은 염기나 아미노산 서열이다. 흔히 진화적으로 멀리 떨어진 서열들을 결과로
얻기 위해 sensitivity를 높이고 싶으면 염기 서열을 번역한 아미노산
서열을 query 서열로 사용한다. 그 이유는 DNA 서열을 4개의
문자 (A, G, C, T)로 이루어져 있어서
20개의 아미노산으로 서열을
이루는 단백질보다 우연히 치환이 일어날 확률이 크고 두개의 서로 다른 염기는 mismatch로만
고려해 점수 (score)를 구하지만 두개의 아미노산은 아미노산의 진화적, 물리적, 화학적
특성에 따라 점수를 차별화해서 부여할 수 있기 때문이다.
그리고 단백질 데이터베이스는 DNA 데이터베이스보다 규모가 작아서 같은 정도의
sensitivity에서 false positive를 얻을 가능성이 낮다.
초기의 유사성 검색 도구들은 Needelman & Wunch (1970)와 Sellers (1974)에 의해 개발되었다. 이들은 비교할 서열들의 전체 길이에 대한 "포괄적인 (global)" 유사성 점수를 계산하였다. 이런 형태의 알고리즘 (algorithm)은 아주 다양화된 (diverged) 서열에 대해서 민감하지 않으므로 유사성 검색보다는 계통도 작성에 사용되는 것이 적당하다. 유사성 검색을 위해 사용될 방법들은 "지역적인 (local)" 유사성을 가지는 지역에 촛점을 맞추어야 한다. 가장 광범위하게 사용되는 알고리즘은 Smith-Waterman (1981), BLAST (1990)과 FASTA (1988)이다. Smith-Waterman 알고리즘은 dynamic programming을 이용하여 전체 서열에서 유사성 검색을 수행하고, FASTA와 BLASTP는 모든 가능한 배열들을 다 조사하지 않는 heuristic 알고리즘을 이용한다. 실제 검색에 있어서 Smith-Waterman 알고리즘이 FASTA나 BLASTP보다 정확한 것으로 알려져 있다. 하지만 EST같은 부분적인 서열의 경우 FASTA도 Smith-Waterman 의 검색 결과와 거의 유사한 결과를 만들어 낸다. BLAST는 효율적인 프로그램으로 대부분의 경우 FASTA와 비슷한 결과를 보여준다. 최근에 개발된 BLAST2.0는 gap filling기능이 보강되어 입력한 서열 전체에서의 유사성을 보여주는 기능을 가지고 있다.
각각의 알고리즘을 이용한 프로그램에 대해 소개하기 전에 검색하는데 항상 고려되는 scoring matrix와 gap penalty에 대한 일반적인 설명이 필요하다.
1. 측정 행렬 (Scoring Matrix)
두개의 서열을 최적으로 배열하는 것 (optimal alignment)은 간단하지 않다. 가장 큰 점수를 가지는 배열 (alignment)이 생물학적 의미를 가진다고 할 때 여러가지 배열들의 점수를 계산하는 방법이 필요하다.
아래의 두개의 아미노산 배열을 고려해 보자. 두개의 배열에서 공통되는 잔기들의 수로 점수를 매긴다고 한다면 두 배열은 9개 중에 5개가 일치하므로 같은 점수일 것이다.
a) TTYGAPPWCS b) TTYGAPPWCS
TGYAPPPWS TGYAPPPWS
* *** * * *** *
그러나 배열 a)는 상대적으로 보편적인 잔기들 (A, P, S, T) 만을 보존하고 있지만 배열 b)에는 W와 T 같은 덜 보편적인 잔기들이 보존되어 있다. 따라서 아미노산들 사이에 생물학적이나 화학적 관계를 반영하여 점수를 매겨야 한다.
측정 행렬 (Scoring matrix)은 두 서열을 비교할 때 각각의 아미노산이나 염기들이 일치 혹은 치환될 확률을 각각 계산해 주는 행렬이다. 실제 서열의 비교에 측정 행렬을 이용하므로 이 측정 행렬은 모든 서열 분석의 기본이 된다. 측정 행렬의 선택은 분석 결과에 중대한 영향을 끼치기 때문에 서열의 적절한 분석을 위해서는 측정행렬을 이해해야 할 필요가 있다.
1-1. 염기 측정 (nucleotide scoring)에 쓰이는 측정 행렬들 (scoring matrix)
DNA 배열에 대한 측정 행렬은 상대적으로 간단하다. 염기의 경우 세가지 정도의 matrix가 주로 사용되고 있다.
1) Identity matrix (similarity)
A T C G
A 1 0 0 0
T 0 1 0 0
C 0 0 1 0
G 0 0 0 1
2) BLAST matrix (similarity)
A T C G
A 5 -4 -4 -4
T -4 5 -4 -4
C -4 -4 5 -4
G -4 -4 -4 5
3) Transition/Transversion Matrix
A T C G
A 0 5 5 1
T 5 0 1 5
C 5 1 0 5
G 1 5 5 0
1-2. 단백질 측정 (protein scoring)에 쓰이는 측정 행렬들
아미노산의 경우 20개가 나올 수 있는 확률의 전부이므로 아미노산의 측정 행렬은 20×20 행렬로 표현할 수 있다. 이 측정 행렬은 두서열의 유사성의 정도를 판단하는 중요한 기준이므로 아미노산의 진화적, 물리적, 화학적 성질을 고려한 여러 개의 행렬이 개발되었고 지금도 계속 개발되어지고 있다. 그 중 현재도 언급되고 있는 genetic code matrix, phisical/chemical characteristics를 이용한 matrix와 현재 가장 일반적으로 많이 이용되는 PAM과 BLUSUM에 관해 좀더 자세히 설명하고자 한다.
1) Genetic code Matrix: 한 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 바뀌는데 필요한 최소한의 염기 서열의 개수 계산
2) Physical/chemical characteristics: 서로 다른 두 아미노산의 물리적, 화학적 성질의 유사성을 이용하여 점수를 부여한 방법 예) hydrophobicity matrix
3) Dayhoff Mutation Data Matrix: Dayhoff 등에 의해 개발된 mutation data matrix (이하 MDM)은 현재 일반적으로 가장 많이 쓰이고 있는 측정 행렬 중의 하나이다. 1968년에 처음 발표되었을 때는 당시에 알려진 단백질 서열들과 그 서열들에서 유추된 ancestral 서열들로부터 얻은 400개의 accepted point mutation을 이용하여 MDM이 제작되었다. 이후 여러 개체들의 서열들이 밝혀짐에 따라 MDM은 계속 확장되어 1980년에는 71개의 연관된 group (서열이 85%이상 동일한 group)들로부터 얻은 1600개의 accepted point mutation들을 근거로 MDM이 제작되었다.
단백질 서열의 mutation에 관한 Dayhoff model은 단백질 치환에 관한 Markovian 모델 (model)을 근거로 한다. Markovian 모델은 한 단백질 내에서의 어떤 특정 위치의 mutation은 다른 위치의 mutation과 무관하다는 것을 전제로 한다.
Markovian 모델 내에서 MDM은 한 단위의 진화적 변화(one unit of evolutionary change) 동안 아미노산 A가 아미노산 B로 치환될 확률을 계산한 transition probability matrix로부터 유도된다. 행렬의 대각선의 값들은 각각의 아미노산이 변하지 않을 확률을 나타낸다. 즉 대각선에 위치한 값들의 합은 주어진 진화 기간(represented evolutionary interval)동안 amino acid가 변하지 않을 확률을 나타내게 된다. Dayhoff derivation에서는 대각선의 값들의 합이 99%가 되게 probability matrix를 조정하였다. 그러므로 probability matrix에서의 진화 단위(unit of evolution)는 100개의 site중 1개의 site에서 accepted amino acid substitution이 일어날 확률에 해당한다. (1 PAM unit). 진화 단위에는 시간적 개념이 전혀 고려되고 있지 않음을 유의해야 한다.
MDM의 중요한 단점은 단백질의 각 site에서 mutation이 일어날 확률은 일정하지 않다는 것이다. 현대 분자 생물학에 있어서 단백질 내에서 각 site에 따라 mutation이 일어날 확률은 다르다는 사실은 잘 알려져 있다. 그러므로 각 site에서의 mutation의 확률을 동일하게 고려한 Dayhoff의 모델은 한계를 가지고 있다.
4) BLOSUM (BLOks SUbstitution Matrix):1991년에 Altschul 등에 의해 발표된 BLOSUM은 현재 BLAST등의 검색에 제공되며 PAM과 함께 가장 많이 쓰이는 치환 행렬의 한 종류이다. BLOSUM은 Block database로부터 개발된 것으로, Block 데이터베이스는 아미노산 서열 중 다른 부분에 비해 굉장히 보존된 (conserved) 부분만을 모아 만든 데이터베이스이다. 이중 일부는 어떤 기능을 가진 motif로 알려져 있다.
PAM이 연관된 서열들과 유추된 서열로부터 치환 확률을 구하는 반면 BLOSUM은 block내에서 아미노산들을 배열한 후 각각의 아미노산들이 짝(pair)을 이루는 확률을 관찰해서 치환 확률을 구한 것이다.
연속적인 치환 행렬을 만들기 위해 서열들을 각각의 block에 clustering을 시키고 clustering percentage는 각각의 group들에 포함시키기 위한 서열들의 최소한의 일치성 (identity)으로 정의한다. 예를 들면 clustering percentage가 35%라면 임의의 서열 A와 B를 배열시켰을 때 적어도 35% 이상의 identity를 가지고 있을 때 같은 group에 포함시키고 BLOSUM35로 정의한다. 또한 임의의 서열 C가 A와 B 둘 중 하나와 35 % 이상의 identity를 가질 경우에 또한 같은 group에 포함 시킨다. 각각의 배열된 아미노산 서열들의 pair들의 갯수를 센 후 서열 A,B,C가 각각 차지하는 비중을 평균하여 측정 행렬 값들을 구한다.
2. Gap penalties
Gap penalty는 삽입 혹은 삭제에 의해 생기는 gap에 얼마의 감점 (penalty)를 줄 것인가를 정하는 것이다. 현재의 통계적 계산으로는 gap penalty를 얼마를 줄 것인가에 대한 정확한 해답은 없지만 여러가지 실험적 사실을 통해 -10, -2에서 -14, -4 정도가 적당하다고 한다. 첫 번째 값은 gap이 처음 생길 때 주는 감점이고, 두 번째 값은 그 다음에 생기는 연속적인 gap에 대한 감점이다. 예를 들면 두 개의 서열 사이에 4개의 gap이 있고, -10, -2의 값을 적용하면 전체 gap penalty는 -10+3×(-2) = -16이 된다. 이렇게 다른 값을 적용하는 이유는 진화상에서 처음 gap이 생기기는 힘들지만 그 이후 연속적으로 생기는 gap은 처음에 비해 쉽게 생길 수 있기 때문이다. 큰 gap penalty (예를 들면 -14, -4)는 partial sequence (EST 같은)의 비교에 적당하다. 사용자는 gap penalty를 조정함으로써 sensitivity를 조절 할 수 있다. 예를 들면 FASTA 검색에서 expectation value가 0.2 이하로 연관성이 거의 없는 서열들이 결과로 출력되었을 때 gap penalty의 값을 올림으로서 이런 서열들을 제거 해 나갈 수 있다.
Smith-Waterman 알고리즘을 이용한 유사성 검색은 앞에서도 언급했듯이 FASTA와 BLAST에 비해 좀더 민감한 (sensitive) 검색 결과를 얻을 수 있지만 검색하는데 시간이 오래 걸린다.
FASTA는 임의의 서열과 유사성을 가진 서열을 서열 데이터베이스로부터 찾는 프로그램이다. FASTA는 단백질 서열간의 비교를 위해 제작되었지만 염기 서열간의 비교도 가능하다. 특히 TFASTA의 경우 입력한 단백질 서열과 염기 서열 데이터베이스 간의 비교도 가능하다. 즉 염기 서열 데이터베이스를 6 frame으로 translation하여 입력한 단백질 서열과 비교하는데 이 기능은 임의의 단백질 서열과 EST 데이터베이스를 검색하는데 좋은 방법으로 알려져 있다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)은
NCBI/GenBank에서 개발된 유사성
검색 프로그램이다.