1.

가. 실험 목표: DNA 염기서열을 다루기 위해서는 이것에 존재하는 여러 가지 정보들을 분석할 수 있어야 한다. 이 실험에서는 진핵생물의 것보다 간단한 원핵생물의 DNA 서열을 가지고 어떤 정보들이 있으며 이들을 어떻게 분석하는지 알아보고자 한다.

나. 실험 내용: DNA 염기서열이 가지고 있는 정보를 이해하지 못하면 이것은 단순히 염기들이 나열된 것에 지나지 않는다. 따라서 어떤 DNA 서열이 가지는 생물학적인 정보를 어떻게 분석해내는가 하는 방법은 매우 중요하다. 일반적으로 DNA 서열이 가지는 정보란 우선 단백질을 암호화하고 있는 유전자의 ORF 부분인지 또는 유전자발현의 관여하는 조절부위 인지, 또는 연구자가 원하는 유전자에 해당하는 지를 알아내는 것이다. 이러한 분석 작업은 특히 긴 서열의 intron을 가지고 있는 진핵생물의 경우 특히 중요하며, 컴퓨터 프로그램들을 통하여 예측이 가능하다. 컴퓨터 프로그램을 통해 DNA 서열에서 단백질 서열에 대한 정보를 담고 있는 부분 (ORF sequence)을 찾아내어 단백질 서열을 예측하는 과정에 대하여 배우고 주어진 과제를 수행한다.

다. 실습
1. DNA 번역: 어떤 세균의 유전자를 클로닝하여 다음과 같은 염기서열을 얻었다고 가정하자. 이 유전자의 염기서열에는 실제 단백질에 대한 정보를 담고 있는 부분과 더불어 앞뒤로 다른 유전자의 서열이 포함되어 있을 수 있다. 우선 이 염기서열을 아미노산 서열로 번역하면 어느 부위가 ORF (open reading frame; 종결 코든이 없이 아미노산을 암호화하는 일련의 triplet codon들을 가지고 있어 실제로 단백질로 번역되는 부분)을 형성하는지 알 수 있다. 이 염기서열은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 간단히 아미노산 서열로 전환시킬 수 있다. 많은 프로그램들이 있으며, 웹 상에서도 분석이 가능하다.
(http://molbiol-tools.ca/molecular_biology_freeware.htm)
Webpage for translation: http://www.expasy.ch/tools/dna.html, http://insilico.ehu.es/translate/

DNA나 단백질 서열을 표기하는 방법은 여러 가지 있지만 흔히 사용되는 양식은 다음과 같다.

DNA 서열 (남세균 Synechocystis sp. PCC 6803에 존재하는 HypP의 유전자 서열)
>slr0078 
GACAGTGATTTGAGATTTTTATGTGGATTATTTATAAGGAGTTTTCCTTTGAGGCGGCCC
ATCAATTGCCCCACCACGAAGGGAAATGTCGACGCTTACATGGCCATAGTTTTCGGGGCC
GGGTTTACGTGGCCAGCGATCGCCTGAAAACCACTGGTTCAGAAACGGGCATGGTGATGG
ACTTTAGTGTGCTCAAAGCCCATTTGGACCCCTTGGTGAAAAATCACCTCGACCATTATT
ACCTCAACGACAGTCTTGGTTTGGAAAGCCCCACCAGTGAGGCGATCGCCGCTTGGATCT
TTGCCAAATTAGAAGAAGCTGGGGTACCGGGGTTACATTCCGTGGAAGTCTTGGAAACCT
GTACCTCCGCCGCCCGTTACTTTTCCCCCCGTTTGTCCCCATTGCTGTGATTTTCGTAAT
CCCTGGGATTAGGGGATTTAACCGAACAAATTGAC

단백질 서열 (위 유전자가 암호화하는 단백질 서열)
>slr0078
MWIIYKEFSFEAAHQLPHHEGKCRRLHGHSFRGRVYVASDRLKTTGSETGMVMDFSVLKA HLDPLVKNHLDHYYLNDSLGLESPTSEAIAAWIFAKLEEAGVPGLHSVEVLETCTSAARYFSPRLSPLL

이러한 표기 방법은 fasta format이라 불리는 양식다.
>로 시작하는 첫머리는 서열이름이고 다음 줄에서부터 DNA 또는 단백질 서열을 순서대로 기록한다.

2. 유전자 서열에 담겨있는 단백질 서열은 어떻게 알아내는가?
어떤 유전자가 확인되면 이것이 암호화하는 단백질을 대량으로 얻거나 그 활성을 분석하기 위하여 대장균이나 기타 여러 가지 생물체에서 발현시키기 위한 클로닝 작업에 들어가야 한다. 이 방법에는 보통 다양한 종류의 과발현 벡터들이 사용되며, 이것에 원하는 유전자 부위, 즉 ORF 부위,를 클로닝하기 위해서는 PCR 증폭과정이 수반된다 (그림 참조). 이때 PCR 반응에 사용할 primer 쌍을 제조해야만 하는데 이것을 만드는 방법에 대해서는 다음 시간에 배우게 될 것이다. 이러한 작업들을 수행하기 위해서는 컴퓨터의 도움이 절대적이며, 이 수업에서는 웹 상에서 이용할 수 있는 몇가지 컴퓨터 프로그램을 사용하여 필요한 분석을 실시하는 요령을 배운다.

Expasy의 Translate 사용 방법
웹사이트로 들어간다.http://web.expasy.org/translate/
빈 창에 위에 열거된 slr0078의 DNA 서열을 복사하여 붙여넣는다.
Output format를 Compact ("M", "-" no spaces)로 선택한다. ("-"는 stop codon)
Genetic code는 standard로 선택한다.
Translate sequence를 클릭한다.
여섯가지 frame으로 번역된 서열 결과가 나타난다. (여섯가지 frame에 대한 설명)
이들 중에서 5'3' Frame 3에서 보여주는 단백질 서열이 위에서 보여주는 단백질 서열과 일치하는 것을 알 수 있다.
일반적으로 ORF에 해당되지 않는 서열은 종결코든이 자주 나타남을 알 수 있다 (이론적으로 매 20개의 codon 마다 하나씩 나타날 확률을 가진다).
ORF를 이루는 아미노산서열을 copy하여 상동성 분석을 해보면 이 서열이 의미있는 단백질 서열인지를 알 수 있다. 현재 단백질이나 DNA 데이터베이스에는 거의 대부분의 단백질 서열들이 올려져 있어 유사성이 있는 것을 찾을 수 있을 것이다. 만약 아무것도 찾아지지 않는다면 전혀 새로운 단백질 서열이거나 잘못 분석된 것일 가능성이 높다.

3. Reverse complement sequence (3'5' Frames) (설명)
어떤 DNA 서열은 그것의 상보적인 서열 (reverse complement sequence)이 의미있는 서열일 수도 있다 (Why?).
다음 DNA 서열을 위와 마찬가지 방법으로 분석해보자.

gtcaatttgttcggttaaatcccctaatcccagggattacgaaaatcacagcaatggggacaaacggg
gggaaaagtaacgggcggcggaggtacaggtttccaagacttccacggaatgtaaccccggtacccca
gcttcttctaatttggcaaagatccaagcggcgatcgcctcactggtggggctttccaaaccaagact
gtcgttgaggtaataatggtcgaggtgatttttcaccaaggggtccaaatgggctttgagcacactaa
agtccatcaccatgcccgtttctgaaccagtggttttcaggcgatcgctggccacgtaaacccggccc
cgaaaactatggccatgtaagcgtcgacatttcccttcgtggtggggcaattgatgggccgcctcaaa
ggaaaactccttataaataatccacataaaaatctcaaatcactgtc

이 서열의 경우는 3'5' Frame 3에서 의미있는 단백질 서열을 보여준다. 그렇다면 위 서열의 reverse complement sequence는 어떻게 알 수 있는가?
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html

이 사이트로 들어가 DNA 서열을 복사하여 붙여넣고 Submit를 클릭한다.

분석결과
DNA 길이, single-strand의 분자량, GC %를 보여준다.
흡광도값은 260 nm에서 1의 값을 가지는 DNA 용액 1 ml에 존재하는 DNA의 몰농도와 양을 보여준다.

(2) 제한효소 자리: 제한효소란 DNA의 특정서열을 인식하여 자르는 효소로서 DNA를 다루는데 중요하게 사용된다. 이들의 자리를 확인함으로써 DNA 클로닝에 유용하게 이용될 수 있다. 다음 웹사이트로 들어가 제한효소 자리를 찾아본다.http://www.restrictionmapper.org/

빈 창에 서열을 붙여넣고 Map sites를 클릭한다.(기본적으로 두 번째 컬럼에 표시된 모든 제한효소에 대한 서열이 찾아지며, 개개의 제한효소를 클릭하여 원하는 제한효소 자리만 찾을 수도 있다.

라. 과제물
각자 다음 표에 제시된 DNA를 분석하여 과제를 해결한다 (반드시 reverse complement도 확인해볼 것).
개인당 하나의 서열이 주어지며 이것은 4번째 수업에서 다시 사용된다.
1. ORF 서열을 찾아낸다. (개시코든은 보통 ATG로 시작되지만 어떤 유전자는 GTG를 사용하기도 한다)
2. 아미노산 서열을 찾아낸다.
3. ORF를 이루는 DNA 서열에 대하여 뉴클레오티드의 조성, 분자량, 흡광도 1에 해당하는 몰농도 값 등을 제출하라.
4. 전체 서열에서 EcoRI, BamHI, HindIII, SmaI 제한효소들이 인식하는 자리를 찾아내어 그림으로 제출한다.
각각의 제한효소가 인식하는 서열도 함께 정리하여 제출한다.

이상의 결과들은 컴퓨터에 정리하고 프린트하여 보고서로 제출한다.

	DNA 서열		DNA 서열		DNA 서열
1	0401	11	1067	21	1137
2	0593	12	1289	22	1237
3	1070	13	0329	23	1347
4	1196	14	0421	24	1349
5	1275	15	0426	25	1418
6	0144	16	0477	26	1538
7	0018	17	0710	27	1626
8	0783	18	0920	28	1734
9	0943	19	1018	29	1793
10	0952	20	1096	30	1796