DNA염기서열의 유지

방금 막 지적하였듯이 때때로 발생하는 유전적 변화는 한 종의 생명체의 오랜기간의 생존을 증가 시킬지라도 개체의 생존은 유전적 안정성이 필요하다. 세포의 DNA 유지 과정이 잘못되는 경우는 매우 드물어서 DNA상의 영구적 변화를 초래한다. 그러한 변화를 졸연변이라고 하고 그것이 DNA상의 중요한 위치에 발생한다면 그것은 한 생명체를 파괴할 수도 있다.

돌연변이율은 매우 낮다

돌연변이율은 DNA상의 관찰 가능한 변화가 발생하는 비율이며, 우리의 대장에 살고 있으며 실험실에서 흔히 사용하는 생명체인 대장균과 같은 세균을 이용한 실험에서 직접 결정될 수 있다. 실험실 조건에서 대장균은 매 40분마다 분열하여 하나의 세포가 하루 이내에 수십조의 세포로된 세포집단을 만들어낼 수 있다. 그러한 집단에서 어떤 특정한 유전자에 해로운 돌연변이가 발생한 일부의 세균을 컴출해 낼 수 있다. 만약 그 유전자가 박테리아의 생존을 위해 필요하지 않다면, 예를 들어, 포도당과 같은 다른 설탕의 존재 하에서 세포가 성장할 때, 에너지원으로서 유당을 사용하기 위해 특이적으로 요구되는 유전자의 돌연변이율을 결정할 수 있다. 손상된 유전자의 비율은 많은 돌연변이가 침묵하기 때문에 실제 돌연변이율을 과소 평가합니다 (예를 들어, 코돈은 변화 시키지만 아미노산은 바뀌지 않거나, 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성에 영향을 미치지 않고 아미노산을 변화시키는 돌연변이). 이러한 침묵 돌연변이를 수정한 후 평균 크기의 단백질 (~103 코딩 뉴클레오타이드 쌍)을 코딩하는 단일 유전자가 약 106 의 박테리아 세포 세대에서 돌연변이 (반드시 단백질을 불활성화시킬 수 있는 돌연변이는 아님)를 한 번 축적한다는 것을 알 수 있다. 달리 말하자면 박테리아는 세포 세대 당 109 개의 뉴클레오타이드 당 약 1 개의 뉴클레오티드 변화의 돌연변이율을 나타낸다

DNA 복제 메커니즘

모든 유기체는 각 세포 분열전에 특별한 정확성으로 DNA를 복제해야합니다. 이 섹션에서는 정교한 "복제 기계"가 DNA를 초당 1000 개의 뉴클레오티드만큼 복제하는 동안 이러한 정확도를 달성하는 방법을 알아봅니다

염기쌍 형성은 DNA 복제와 DNA 수선의 기초가 됩니다.

R 장에서 소개했듯이, DNA를 주형을 사용하여 복제하는 것은 세포가 하나의 DNA 가닥의 염기 서열을 상보적인 DNA 서열로 복사하는 데 사용하는 메커니즘입니다 (그림 5-2). 이 과정은 자유로운 (DNA로 합성 안된) 상보적 뉴클레오타이드에 의한 DNA 주형 가닥의 각 뉴클레오타이드의 인식을 수반하며 DNA 나선의 두 가닥 분리가 필요합니다. 이 분리는 적절한  자유 뉴클레오타이드가 DNA에 들어있는 염기와 염기쌍을 형성할 수 있도록 각 DNA 가닥의 염기에 있는 수소 결합 공여자와 수용체 그룹을 노출 시키며, 새로운 DNA 사슬로 효소 촉매 반응에 의해 중합될수 있도록 배열시킨다.

첫 번째 핵산 중합 효소인 DNA 중합 효소는 1957 년 발견되었다.이 효소의 기질로 사용되는 자유 뉴클레오타이드는 디 옥시 리보 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (deoxyribonucleoside triphosphates) 인 것으로 밝혀졌으며, DNA 로의 중합 (polymerization)을 위해서는 한 가닥의 DNA 주형이 필요했다. 그림 5-3과 그림 5-4는이 반응의 단계적  메커니즘을 보여줍니다.

DNA 복제 포크는 비대칭 적입니다.

세포 내에서의 DNA 복제 중에 두 개의 원래 DNA 가닥은 모두 새로운 가닥을 형성하기위한 주형으로 사용됩니다. 분열하는 세포의 두 딸은 각각 원래의 하나의 가닥과 하나의 새로운 가닥 (그림 S-5)이 포함 된 새로운 DNA 이중 나선을 물려 받기 때문에 DNA 이중 나선은 DNA 중합 효소에 의해 "반보존적으로" 복제된다고합니다. 이 묘기는 어떻게 수행 되는가?

1960년대 초에 복제중인 염색체에 대한 분석을 수행하였는데 복제가 일어나는 한 부분이 DNA 이중나선상에서 점진적으로 이동하는 것으로 나타났다. 이 부분의 모양이 Y자 형이기 때문에 이 활성 부위를 복제분기점이라고 한다.(그림 5-6). 복제 분기점에서는 DNA 중합효소를 포함하는 다중효소 복합체가 두 개의 딸 가닥을 합성한다.

처음에는  DNA 복제의 가장 간단한 메커니즘은 복제 분기점이 DNA 분자의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 이동함에 따라   뉴클레오타이드가 연속적으로 성장하는 것처럼 보였습니다. 그러나 DNA 이중 나선 구조 (그림 5-2 참조)에서 두 개의 DNA 가닥의 역 평행 배열 때문에 이 메커니즘은 하나의 딸 가닥이 5 '에서 3'방향으로 중합하고 다른 하나는 3 ' - 5 '방향으로 중합되어야 그 기작이 설명이 된다. 이러한 복제 포크는 두 가지 서로 다른 DNA 중합 효소 유형을 필요로 합니다. 그러나, 발견 된 많은 DNA 중합 효소는 모두 5 '에서 3'방향으로 만 합성할 수 있습니다.

그러면 DNA 가닥이 3 '에서 5'방향으로 성장할 수 있습니까? 그에 대한 대답은 1960 년대 초반에 수행 된 실험 결과에 의해 처음 제안되었습니다. 연구진은 몇 초 동안 매우 방사성이 강한  3H-thymidine을 분열하는 박테리아에 첨가하여 복제 포크 바로 뒤에있는 가장 최근에 복제 된 DNA 만 방사성 표지가되도록 했습니다. 이 실험은 성장중인 복제 분기점에 현재 오카자기 절편이라고 불리는 1000-2000 개의 뉴클레오티드 길이의 DNA 조각이 일시적으로 존재함을 보여주었습니다. 이와 비슷한 복제 중간체가 후에 진핵세포에서도 발견되었느데 그 경우는 100~200 뉴클레오티드이었다). 오카자기 절편은 5‘ to 3’ 방향으로만 합성되는 것으로 나타났으며 합성된 후 서로 연결되어 긴 사슬로 만들어 졌다.

그러므로 복제분기점은 비 대칭구조이다(그림5-7). 연속적으로 합성되는 딸 DNA 가닥은 선도가닥이라고 알려져 있다. 선도가닥의 합성은 지연가닥이라고 알려진 불연속적으로 합성되는 가닥보다 더 빨리 진행된다. 지연가닥의 합성방향은 전박적인 DNA 사슬의 성장 방향과 반대이다. 이 지연가닥의 후연결 기전은 DNA복제는 5‘to3’ 형의 DNA 중합효소만 요구됨을 의미한다.

DNA 복제의 충실도는 몇가지 교정 메커니즘을 필요로합니다.

위에서 설명한 것처럼 복제 중 DNA를 복제하는 충실도는 109 뉴클레오티드가 복사 될 때마다 한번의 실수만 발생한다는 것입니다. 이 충실도는 상보적 짝짓기의 정확도로 기대되는 것보다 훨씬 높습니다. 표준 상보적 염기쌍 (그림 4-4 참조)만이 가능한 것은 아닙니다. 예를 들어, 헬릭스 기하학의 작은 변화로 DNA에서 G와 T 사이에 두 개의 수소 결합이 형성 될 수 있습니다. 또한, 4 개의 DNA 염기는 104 ~105의 비율로 토토머를 드물게 일시적으로 만든다. 이들은 나선 구조의 변화 없이도 잘못된 짝을 형성된다 : 예를 들어 C 토토머는 G 대신 A와 짝을 이룬다.

들어오는 데 옥시 리보 뉴클레오티드 트리 포스페이트와 DNA 주형 사이에 미스페어링이 발생했을 때 DNA 중합 효소가 특별한 일을하지 않는다면 잘못된 뉴클레오타이드가 종종 새로운 DNA 사슬에 통합되어 빈번한 돌연변이를 일으킬 것이다.. 그러나 DNA 복제의 충실도는 최초의 염기쌍 형성뿐만 아니라 발생했을 수도 있는 초기의 잘못된 쌍을 교정하기 위해 순차적으로 작용하는 여러 가지 "교정 (proofreading)"메커니즘에 의존한다. DNA 중합 효소는 성장하는 사슬에 새로운 뉴클레오타이드가 첨가되기 바로 전에 첫 번째 교정 단계를 수행합니다. 이 메커니즘에 대한 우리의 지식은 대장균 내부에서 복제하는 박테리아 바이러스 T7에 의해 생성 된 DNA 중합 효소를 비롯하여 여러 가지 DNA 중합 효소에 대한 연구에서 비롯된 것입니다. 정확한 뉴클레오티드는 틀린 뉴클레오타이드보다 이동하는 폴리머 라제에 대해 더 높은 친 화성을 갖는다. 왜냐하면 정확한 쌍이 더 에너지 적으로 유리하기 때문이다. 또한 뉴클레오타이드 결합 후에 뉴클레오타이드가 성장하는 사슬에 공유 결합되기 전에 효소는 "손가락"이 활성 부위 주위를 조이는 갓과 유사한 형태 변화를 겪어야한다 (그림 5-4 참조). 이 변화는 부정확 한 염기쌍 보다 정확한 염기쌍이 형성될 경우 더 잘 일어나므로 뉴클레오티드 첨가를 촉진하기 전에 정확한 염기쌍을 "재 점검"할 수 있습니다.

다음 오류 수정 반응은, exonucleolytic 교정으로 알려진 것으로 잘못된 뉴 클레오 티드가 성장하는 사슬에 공유 결합으로 추가되는 드문 경우 다음에 즉시 발생합니다. DNA 중합 효소 그들이 합성할  DNA 사슬의 유형을 매우 잘 구별합니다 : 그들은 이전에 형성된 프라이머 가닥의 3'-OH 말단을 필요로합니다. 만약 이 3'-OH말단의 염기가 잘못 짝을 이루면 중합효소가 가닥을 더 합성할 수 없기 때문에 프라이머 가닥으로 사용될 수 없습니다. 중합효소는 그렇게 잘못된 짝을 또 다른 촉매 부위(이 촉매부위는 중합효소에 따라서 중합효소의 다른 소단위에 있을 수도 있고 중합효소분자의 다른 지역일 수도 있다)를 이용하여 교정합니다. 이 3‘to5’ 교정 exonuclease는 프라이머로 사용될 수 있는 올바른 프라이머 말단이 나올때까지  잘못 짝을 이룬 뉴클레오티드를 포함하여 뉴클레오티드를 충분히 잘라낸다. 이러한 방법으로 DNA중합효소는 DNA상에서 움직이면서 스스로의 합성 실수를 제거하게 된다.

Lagging Strand에서 짧은 RNA Primer 분자를 합성하는 특수 Nucleotide-Polymerization 효소

Leading strand의 경우 특수 프라이머는 복제 시작시에만 필요합니다. 일단 복제 포크가 형성되면 DNA 중합 효소는  뉴클레오타이드를 추가 할 사슬 말단에 지속적으로 새로운 염기쌍을 만나게 됩니다 . 그러나 DNA 폴리 메라 아제가 짧은 DNA 오카자키 단편 (몇 초 걸림)을 완성 할 때마다 주형 가닥을 따라 더 멀리 떨어진 부위에서 완전히 새로운 단편을 합성하기 시작해야합니다 (그림 5- 7). 특별한 메카니즘은 이 DNA 중합 효소 분자가 필요로하는 염기 짝짓기로 된 프라이머 스트랜드를 생성한다. 그 메커니즘은 DNA primase 라 불리는 효소가 관여하는데,이 효소는 지연 가닥에서 짧은 RNA primer를 합성하기 위해 ribonucleoside triphosphates를 사용합니다 (그림 5-ll). 진핵 생물에서, 이들 프라이머는 약 10 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 지연가닥상에 100-200 뉴클레오타이드의 간격으로 만들어진다. RNA의 화학 구조는 1 장에서 소개되었으며 6 장에서 자세하게 설명됩니다. 여기서 RNA는 DNA와 구조가 매우 유사하다는 점만 주목하십시오. RNA 가닥은 DNA 가닥과 염기쌍을 형성하여 두 개의 염기 서열이 상보적인 경우 DNA / RNA 하이브리드 이중 나선을 생성합니다. 따라서 DNA 합성에 사용 된 동일한 템플레이트 원리가 RNA 프라이머의 합성을 일어나게 합니다. RNA 프라이머는 적절하게 염기쌍을 이루고 있는 3'-OH 말단이  때문에 이 부분에서 DNA 중합 효소에 의해 연장되어 오카자키 조각을 만들 수 있습니다. 각 오카자키 조각의 합성은 이 DNA 중합 효소가 이전 단편의 5 ' 말단에 붙어있는 RNA 프라이머와 만날때 끝납니다. 지연 가닥에서 만들어진 많은 DNA 단편으로부터 연속적인 DNA 사슬을 생산하기 위해 특별한 DNA 복구 시스템이 빠르게 작동하여 오래된 RNA 프라이머를 지우고이를 DNA로 대체합니다. DNA ligase 라 불리는 효소는 새로운 DNA 단편의 3 '말단과 이전 DNA 단편의 5'말단을 연결하여 과정을 완료한다 (그림 5-12와 5-F3).

특수 단백질은 복제 포크 앞에서 DNA Double Helix를 여는 데 도움을 줍니다

DNA 합성을 진행하려면 들어오는 데 옥시 리보 뉴클레오티드 트리 포스페이트가 주형 가닥과 염기쌍을 형성 할 수 있도록 DNA 이중 나선을 복제 포크보다 먼저 개방해야합니다. 그러나, DNA 이중 나선은 생리 조건 하에서 매우 안정하다. 염기 쌍이 너무 강하게 고정되어 시험관에서 두 가닥을 분리하기 위해 끓는 물에 가까울 정도로 온도를 높여야 합니다. 이러한 이유로 이중 나선을 열어서 DNA 중합 효소가 복제 할 수 있는 적절한 단일 DNA 주형을 제공하기 위해 DNA 헬리 카제와 단일 가닥 DNA 결합 단백질의 두 가지 추가 유형의 복제 단백질이 필요합니다.

DNA 헬리 케이즈는 DNA의 단일 가닥에 결합 될 때 ATP를 가수 분해하는 단백질로 처음 분리되었습니다. 3 장에서 설명했듯이, ATP의 가수 분해는 단백질 분자가 주기적으로 변형되어 단백질이 기계적 작업을 수행 할 수 있게 합니다. DNA 헬리 케이즈는이 원리를 이용하여 DNA 단일 가닥을 따라 빠르게 추진하여 이동합니다.  그들이 이중 나선의 영역을 만났을 때, 그들은 가닥을 따라 계속 움직이면서, 초당 최대 1000 개의 뉴클레오티드 쌍의 비율로 나선을 분리시킨다 (그림 5-14와 5-15).

DNA의 두 가닥은 반대 극성을 가지며 원칙적으로 헬리 케이즈는 한 가닥을 따라 5 '에서 3'방향으로 또는 다른 한 가닥을 따라 3 '에서 5'방향으로 이동하여 DNA 이중 나선을 풀 수 있습니다. 사실 두 종류의 DNA 헬리 케이즈가 존재합니다. 박테리아의 가장 잘 알려진 복제 시스템에서, 지연 가닥 주형을 따라 5 '에서 3'방향으로 움직이는 헬리 카아 제가 곧 중요한 역할을 하는 것으로 보이며 그이유는 곧 설명하겠습니다.

나선형 불안정화 단백질이라고도 불리는 단일 가닥 DNA 결합 (SSB) 단백질은 염기를 덮지 않고 노출 된 단일 가닥 DNA에 단단히 결합하여 템플레이트로 사용할 수 있도록 합니다. 이 단백질은 긴 DNA 나선을 직접 열 수 없지만 풀린 단일 가닥 구조를 안정화하여 헬리 카제를 돕습니다. 또한, 이들의 공동 결합은 지연 가닥 주형에서 단일 가닥 DNA의 영역을 둘러싸고 곧게 만들 어서 단일 가닥 DNA에서  짧은 머리핀 나선이 쉽게 형성되는 것을 방지합니다 (그림 5-16 및 5-17 ). 이러한 머리핀 나선은 DNA 중합 효소에 의해 촉매 된 DNA 합성을 방해 할 수 있습니다.

Strand-directed Mismatch Repair 시스템은 복제 기계의 교정에서 교정이 안된 복제 오류를 제거합니다.

앞서 언급했듯이 E. coli와 같은 박테리아는 40 분에 한 번 분열 할 수 있기 때문에 대규모 집단을 스크리닝하여 세포 특정 프로세스에서 변화된 돌연변이 세포를 찾는 것이 상대적으로 쉽다. 한 가지 재미있는 돌연변이 클래스는 자발적 돌연변이의 속도를 크게 증가시키는 돌연변이 유전자 (mutator genes)의 변형을 포함합니다. 당연히 그러한 한 돌연변이 중 하나는  DNA 폴리 메라 이제 효소의 일부인 3'-5 '교정 교정 엑소 뉴 클레아 제가 결핍된 돌연변이 형태이다. (그림 5-B와 5-9 참조). 돌연변이 DNA 중합 효소는 효과적으로 교정하지 않으며, 제거 될 수 있었던 많은 복제 오류가 DNA에 축적됩니다.

비정상적으로 높은 돌연변이 속도를 보이는 다른 대장균 돌연변이의 연구는 교정 엑소 뉴 클레아 제가 놓친 폴리 메라 이제에 의한 복제 오류를 제거하는 교정 시스템을 밝혀 냈습니다. 이 strand-directed mismatch repair system은 noncomplementary base pairs 사이의 misfit으로부터 DNA 나선의 왜곡 가능성을 감지합니다. 교정 시스템이 새로 복제 된 DNA의 불일치를 단순히 인식하고 두 개의 미스 매치 뉴클레오타이드 중 임의의 하나를 무작위로 보정한다면, 원래의 템플레이트 가닥을 정정할 가능성이 정확히 절반이 되어 전체적인 오류율을 낮추지 못할 것입니다. 효과적인 교정을 위해서, 그러한 교정 시스템은 복제 오류가 발생한 새롭게 합성 된 가닥에 있는 잘못 짝지워진 뉴클레오타이드를 구별하고 제거 할 수 있어야한다.

대장균에서의 미스매치 교정 시스템에 의해 사용 된 가닥 - 구별 메카니즘은 DNA에서 선택된 A 잔기의 메틸화에 의존한다. 메틸기는 GATC 서열의 모든 A 잔기에 첨가되지만, A가 새로 합성 된 DNA 사슬에 결합 된 후에는 얼마동안은 메칠화 되지 않느다. 결과적으로, 아직 methylated되지 않은 GATC 시퀀스는 복제 포크 바로 뒤의  새로운 가닥에 만 있습니다. 이러한 비 메틸화 GATC의 인식은 새로운 DNA 가닥이 일시적으로 구형 DNA와 구별되게고, 그 미스매치가 선택적으로 제거되어기 위해 필요하다. 3 단계 과정은 미스매치 인식, 미스매치가 있는 새로 합성 된 가닥 DNA 단편의 절제, 원래 주형으로 사용된 된 가닥을 주형으로 사용하여 절단 된 단편의 재 합성을 포함한다. 이 strand-diredted 미스 매치 수리 시스템은 DNA 복제 중에 발생하는 오류의 수를 100 배로 줄입니다 (표 5-1, 27 페이지 참조).

DNA Topoisomerases는 복제 중 DNA 꼬임을 방지합니다.

복제 포크가 이중 가닥 DNA를 따라 이동함에 따라, "winding 문제"라고 불리는 것을 만듭니다. 포크에서 복제 된 각 10 염기쌍마다 부모 이중 나선의 축을 중심으로 하나의 완전한 회전에 해당합니다. 따라서 복제 포크를 이동하려면 포크 앞에있는 전체 염색체가 정상적으로 빠르게 회전해야합니다 (그림 5-21). 이것은 긴 염색체에 대하여 많은 양의 에너지를 필요로 할 것이므로 그 대신에 다른 전략이 사용됩니다 : DNA 토포 이소 머라 제 (topoisomerases)로 알려진 단백질에 의해서 DNA 나선형에 스위블(회전이음쇠)이 형성됩니다.