DNA 염기서열의 분석

4. DNA 염기서열의 분석

가. 실험 목표: DNA 염기서열을 다루기 위해서는 이것에 존재하는 여러 가지 정보들을 분석할 수 있어야 한다. 이 실험에서는 진핵생물의 것보다 간단한 원핵생물의 DNA 서열을 가지고 어떤 정보들이 있으며 이들을 어떻게 분석하는지 알아보고자 한다.

나. 실험 내용: DNA 염기서열이 가지고 있는 정보를 이해하지 못하면 이것은 단순히 염기들이 나열된 것에 지나지 않는다. 따라서 어떤 DNA 서열이 가지는 생물학적인 정보를 어떻게 분석해내는가 하는 방법은 매우 중요하다. 일반적으로 DNA 서열이 가지는 정보란 우선 단백질을 암호화하고 있는 유전자의 ORF 부분인지 또는 유전자발현의 관여하는 조절부위 인지, 또는 연구자가 원하는 유전자에 해당하는 지를 알아내는 것이다. 이러한 분석 작업은 특히 긴 서열의 intron을 가지고 있는 진핵생물의 경우 매우 중요하다. 이러한 작업은 주로 웹이나 PC에서 컴퓨터 프로그램들을 통하여 이루어진다. 이러한 정보들로부터 유전자가 확인되면 이것이 암호화하는 단백질을 대량으로 얻거나 그 활성을 분석하기 위하여 대장균이나 기타 여러 가지 생물체에서 발현시키기 위한 클로닝 작업에 들어가야 한다. 이 방법에는 보통 다양한 종류의 과발현 벡터들이 사용되며, 이것에 원하는 유전자 부위, 즉 ORF 부위,를 클로닝하기 위해서는 PCR 증폭과정이 수반된다 (그림 참조). 이때 PCR 반응에 사용할 primer 쌍을 제조해야만 하는데 이것을 만드는 방법에 대해서는 다음 시간에 배우게 될 것이다. 이러한 작업들을 수행하기 위해서는 컴퓨터의 도움이 절대적이며, 여기서는 30일간 공짜로 사용할 수 있는Genamics Expression이라는 프로그램을 사용하여 필요한 분석을 실시하는 요령을 배운다.

다. 실습
1. DNA 번역: 어떤 유전자를 클로닝하여 다음과 같은 염기서열을 얻었다. 이 유전자의 염기서열을 어떻게 분석하는지 살펴보자. 우선 이 염기서열을 아미노산 서열로 번역하면 어느 부위가 ORF (open reading frame; 종결 코든이 없이 아미노산을 암호화하는 일련의 triplet codon들을 가지고 있어 실제로 단백질로 translation 되는 부분)을 형성하는지 알 수 있다. 이 염기서열은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 간단히 아미노산 서열로 전환시킬 수 있다. 많은 프로그램들이 있으며, 웹 상에서도 분석이 가능하다.
Webpage for translation: http://www.expasy.ch/tools/dna.html
Softwares for DNA analysis: http://genamics.com (이곳에는 생물학연구에 사용할 수 있는 다양한 종류의 software들이 수집되어 있다) or download here for Genamics Expression, accessory file, and Key file

>Synechocystis sp. strain PCC6803 2880746-2881200 (2880766-2881155)

GACAGTGATTTGAGATTTTTATGTGGATTATTTATAAGGAGTTTTCCTTTGAGGCGGCCC
ATCAATTGCCCCACCACGAAGGGAAATGTCGACGCTTACATGGCCATAGTTTTCGGGGCC
GGGTTTACGTGGCCAGCGATCGCCTGAAAACCACTGGTTCAGAAACGGGCATGGTGATGG
ACTTTAGTGTGCTCAAAGCCCATTTGGACCCCTTGGTGAAAAATCACCTCGACCATTATT
ACCTCAACGACAGTCTTGGTTTGGAAAGCCCCACCAGTGAGGCGATCGCCGCTTGGATCT
TTGCCAAATTAGAAGAAGCTGGGGTACCGGGGTTACATTCCGTGGAAGTCTTGGAAACCT
GTACCTCCGCCGCCCGTTACTTTTCCCCCCGTTTGTCCCCATTGCTGTGATTTTCGTAAT
CCCTGGGATTAGGGGATTTAACCGAACAAATTGAC

>slr0078 (Synechocystis sp. strain PCC6803) MWIIYKEFSFEAAHQLPHHEGKCRRLHGHSFRGRVYVASDRLKTTGSETGMVMDFSVLKA HLDPLVKNHLDHYYLNDSLGLESPTSEAIAAWIFAKLEEAGVPGLHSVEVLETCTSAARYFSPRLSPLL

2. 번역:
Genamics Expression software를 다운로드하여 프로그램을 설치한다.
프로그램을 열고, File →New →DNA를 클릭하면 새로운 창이 열린다.
위에 열거된 염기서열을 copy하여 붙여놓는다 (만약 프로그램이 다운되는 일이 발생하면 위 서열을 메모장에 붙인 후에 다시 복사하여 붙이면 문제가 해결된다).
ORF Map을 클릭한다. 새로운 창이 생기면서 아미노산 서열이 나타난다.
ORF Mapper에서 Frame을 바꾸어가면서 아미노산 서열의 변화를 관찰한다 (그림 참조).
염기서열 하단에 열거한 아미노산 서열과 비교하여 맞는 Frame을 찾는다.
일반적으로 ORF에 해당되지 않는 서열은 종결코든이 자주 나타남을 알 수 있다 (이론적으로 매 20개의 codon 마다 하나씩 나타날 확률을 가진다).
ORF를 이루는 아미노산서열을 copy하여 상동성 분석을 해보면 이 서열이 의미있는 단백질 서열인지를 알 수 있다. 현재 단백질이나 DNA 데이터베이스에는 거의 대부분의 단백질 서열들이 올려져 있어 유사성이 있는 것을 찾을 수 있을 것이다. 만약 아무것도 찾아지지 않는다면 전혀 새로운 단백질 서열이거나 잘못 분석된 것일 가능성이 높다.

어떤 DNA 서열은 그것의 상보적인 서열이 의미있는 서열일 수도 있다. 다음 DNA 서열을 위와 마찬가지 방법으로 분석해보자.

gtcaatttgttcggttaaatcccctaatcccagggattacgaaaatcacagcaatggggacaaacggg
gggaaaagtaacgggcggcggaggtacaggtttccaagacttccacggaatgtaaccccggtacccca
gcttcttctaatttggcaaagatccaagcggcgatcgcctcactggtggggctttccaaaccaagact
gtcgttgaggtaataatggtcgaggtgatttttcaccaaggggtccaaatgggctttgagcacactaa
agtccatcaccatgcccgtttctgaaccagtggttttcaggcgatcgctggccacgtaaacccggccc
cgaaaactatggccatgtaagcgtcgacatttcccttcgtggtggggcaattgatgggccgcctcaaa
ggaaaactccttataaataatccacataaaaatctcaaatcactgtc

이 서열의 경우는 의미있는 단백질 서열을 보여주지 않는다. 메뉴의 Sequence에서 Reverse complement를 누르면 상보적인 서열로 바뀌는 것을 볼 수 있다. 어떤 결과가 나오는가?

3. DNA 특성 분석: 메뉴의 Calculator를 열면 Calculator를 비롯하여 여러 가지 항목이 나온다. 이들에 대하여 알아보자.

Calculator를 누르면 ATGC의 %, single-strand의 분자량, 흡광도 값들이 주어진다.
흡광도값은 260 nm에서 1의 값을 가지는 DNA 양과 몰농도를 보여주는 것이다. 글자의 일부가 깨져서 나올 수가 있는데 그 단위는 ugmL^-1 또는 mmolL^-1로서 ug/mL 과 mmol/L를 의미하는 것이다.

Enzyme digester는 제한효소 자리들을 보여준다. 제한효소란 DNA의 특정서열을 인식하여 자르는 효소로서 DNA를 다루는데 중요하게 사용된다. 이들의 자리를 확인함으로써 DNA 클로닝에 유용하게 이용될 수 있다. 찾아진 각 제한효소를 누르면 왼쪽 화면에 직선상에 제한효소가 표시된다. 다른 제한효소 자리들을 같이 표시하고 싶으면 Control 키를 누른채 다른 제한효소들을 눌러나간다. 이 그림은 복사하여 붙일 수 있다.

ORF finder는 위에서 사용한 것이다.

Pattern finder란 특정한 서열을 찾아주는 것으로 오른쪽 상단 부분에 서열을 타이핑한 후에 Find를 누르면 일치하는 서열이 있을 경우 하단에 표시하여 준다.

Primer calculator와 Primer designer에 대해서는 다음 시간에 다루도록 하겠다.

4. 단백질 서열의 분석
위에서 찾아진 서열을 가지고 상동단백질의 검색, 아미노산 조성, 분자량, 등전점값 (pI), 2,3 차 구조 분석 등을 실시하면 관련된 많은 정보들을 얻어낼 수 있다. 단백질 내에 존재하는 아미노산 잔기들의 평균분자량은 110이다. 아미노산의 평균분자량은 138이지만 단백질 내의 분포를 고려하여 단백질에 존재하는 아미노산들의 평균분자량은 128로 잡는다. 아미노산들은 펩타이드 결합을 이루면서 물 한 분자를 잃어 버리므로 18을 빼면 아미노산 잔기들의 평균분자량은 110에 해당한다. 따라서 어떤 단백질의 아미노산 잔기의 수를 알면 여기에 110을 곱하여 대략적인 분자량을 알 수 있다. 또는 역으로 SDS-PAGE나 gel filtration chromatography를 통해 단백질의 분자량을 알면 아미노산 잔기들의 수도 대략 예상할 수 있다. 그렇지만 단백질의 아미노산 서열을 알면 보다 정확한 분자량을 알아낼 수 있다.

우선 상동성 분석은 앞에서 다룬 내용을 참조하라.
분자량과 등전점값은 Swiss Expasy의 한국 mirror site인 (http://kr.expasy.org/tools/protparam.html)에서 분석할 수 있다.
이외에도 2,3 차 구조분석을 비롯하여 많은 정보들이 분석될 수 있지만 생략토록 하겠다. 관심이 있는 사람은 http://kr.expasy.org/tools/protparam.html를 방문해보기 바란다. 단백질의 이차구조를 이해하는 것은 단백질이 어떤 구조를 이루는지 이해하는데 큰 도움이 된다. 정확한 분석은 단백질 결정에 대한 X-선 회절분석을 통해서만 얻을 수 있지만, 컴퓨터 프로그램을 통해 어느 정도의 예측도 가능하다. 이차구조를 정확히 예측할 수 있다면 삼차원 구조를 예측하기가 매우 쉬워지지만 현재 이차구조 예측의 정확도는 70-80% 정도에 머무르고 있다.

라. 과제물
각 조는 다음 표에 제시된 DNA를 분석하여 과제를 해결한다 (반드시 reverse complement도 확인해볼 것).
1. ORF 부위에 해당하는 서열을 찾아낸다. (개시코든은 보통 ATG로 시작되지만 어떤 유전자는 GTG를 사용하기도 한다)
2. ORF의 아미노산 서열을 가지고 상동성 검색을 실시하여, 어떤 단백질의 아미노산 서열에 해당되는지 찾아내라.
적어도 2가지 이상의 상동 단백질 서열과 다중배열을 실시하여 그 결과를 첨부하라.
3. 아미노산 서열의 아미노산 조성, 분자량, 등전점값등을 얻어내라.
4. ORF를 이루는 DNA 서열에 대하여 ATGC의 조성, 분자량, 흡광도 1에 해당하는 몰농도 값 등을 제출하라.
5. 어떤 제한효소 자리들이 존재하는 지 분석한 후 그림으로 제출한다.

조	DNA 서열	조	DNA 서열
1	0401	7	0018
2	0593	8	0783
3	1070	9	0943
4	1196	10	0952
5	1275	11	1067
6	1538	12	1289
		13	1796