3.primer 쌍의 제조

4. PCR primer 쌍의 고안

가. 실험목표
PCR (Polymerase Chain Reaction)은 실험관 내에서 DNA를 증폭하는 실험으로 많은 연구에 이용되고 있다. 이번 실험에서는 특정 유전자 서열을 증폭하여 클로닝하는데 필요한 PCR 증폭과정과 primer쌍을 고안하는 방법에 대하여 배우도록 하겠다.

나. 실험내용
PCR은 다양한 실험에 사용되지만 여기서는 특정 유전자가 암호화하는 단백질을 대량으로 얻기 위하여 발현벡터를 제조하는데 방법에 대하여 배우도록 한다. 이 실험에는 보통 다양한 종류의 과발현 벡터들이 사용되며, 이것에 원하는 유전자 부위, 즉 ORF 부위,를 클로닝하기 위해서는 PCR 증폭과정이 수반된다 (지난 주 그림 참조). 이때 PCR 반응을 이용하는데 그 실험 자체는 매우 간단하지만 primer 쌍을 제조하기 위해서는 적절한 것들을 고안할 줄 알아야만 한다. 이것을 고안하기 위해서는 컴퓨터의 도움이 절대적이며, 여기서는 지난 실험에 사용한 Genamics Expression을 사용하여 필요한 분석을 실시하는 요령을 배운다.

다. 실습
1. primer 쌍의 고안

ORF가 확인되었으면 이것을 발현시키기 위한 클로닝 작업에 들어간다.

연구목적에 따라 다양한 종류의 클로닝 벡터들이 개발되어 있따. 여기서는 대장균에서 과발현시키기 위하여 Novagen에서 개발된 pET-28a 과발현 벡터에 클로닝하는 과정을 설명하고자 한다.

발현이 제대로 이루어지기 위해서는 ORF 서열이 클로닝 벡터의 reading frame에 맞도록 클로닝되어야만 한다. 클로닝 부위에는 클로닝에 필요한 제한효소 자리들이 모여있다. 이를 multicloning site ( MCS )라 부른다. 이런 제한효소자리에 클로닝 하기 위해서는 증폭된 DNA도 동일한 제한효소로 잘라야만 하므로 혹시 DNA 내부에 제한효소자리가 있는 지를 확인할 필요가 있다.

2. primer 분석

>PCC2880746 (빨간색 서열은 ORF sequence)

GACAGTGATTTGAGATTTTTATGTGGATTATTTATAAGGAGTTTTCCTTTGAGGCGGCCC
                    
ATCAATTGCCCCACCACGAAGGGAAATGTCGACGCTTACATGGCCATAGTTTTCGGGGCC
 
GGGTTTACGTGGCCAGCGATCGCCTGAAAACCACTGGTTCAGAAACGGGCATGGTGATGG
 
ACTTTAGTGTGCTCAAAGCCCATTTGGACCCCTTGGTGAAAAATCACCTCGACCATTATT
 
ACCTCAACGACAGTCTTGGTTTGGAAAGCCCCACCAGTGAGGCGATCGCCGCTTGGATCT
 
TTGCCAAATTAGAAGAAGCTGGGGTACCGGGGTTACATTCCGTGGAAGTCTTGGAAACCT
 
GTACCTCCGCCGCCCGTTACTTTTCCCCCCGTTTGTCCCCATTGCTGTGATTTTCGTAAT
 
CCCTGGGATTAGGGGATTTAACCGAACAAATTGAC

PCR증폭에 필요한 primer 쌍으로 upper와 lower primer 각각을 다음과 같이 제조하였다.
upper (또는 forward) primer : CATATGTGGATTATTTATAAGGAGTTTTCC (Nde I )
lower (또는 reverse) primer : GGATCCTCACAGCAATGG (Bam HI)

기본적으로 발현벡터에 클로닝하기 위해서는 upper primer는 개시코든을 포함하는 서열, lower primer는 종결코든을 포함하는 서열을 가지고 제조한다. 밑줄친 부분은 클로닝을 위해 해당하는 제한효소를 넣은 것이다. 이 primer들의 Tm 값을 아래의 웹사이트로 들어가 알아보자.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator

***다른 목적으로 PCR primer를 고안하기 위해서는 다음과 같은 여러 가지 조건들이 충족되어야만 한다.

PCR에 적합한 primer 쌍을 고안하는데 필요한 주의사항

* 50 ~60 % G + C ratio

* 18 ~ 28 nucleotide 길이

* 55~ 80 ℃ Tm 값 ( 2℃ for A or T, 4℃ for G or C )

* primer 쌍은 비슷한 Tm 값을 가지고 3' 말단에서 서로간에 상보성을 가지지 않도록 한다

* primer 말단에 G 또는 C가 3개 이상 연이어 있지 않도록 한다. DNA 복제가 시작되는 3' 말단에 GC가 높으면 앞의 서열에서 상보성이 없더라도 DNA 복제가 일어날 수 있기 때문이다.

* primer들은 palindromic 구조를 가지지 않도록 한다. Primer 간의 결합이 일어날 수 있기 때문이다.

ΔG3' : 3' 쪽의 안정성에 관한 값으로 3'으로부터 5개 염기들의 ΔG값이다. 이 값이 높을수록 (less negative ΔG) 잘못 priming될 가능성이 낮아진다. (ΔG 값이 낮다는 것은 안정한 결합을 의미한다. 따라서 앞부분의 서열과는 상관없이 이 부분의 결합만으로 priming이 일어날 수 있다는 것을 의미한다).

ΔG5' (GC Clamp) : 5'쪽의 안정성에 관한 값으로 5'으로부터 5개 염기들의 ΔG값이다. 이 값이 낮을수록 (more negative ΔG) 보다 효율적인 priming이 이루어진다.

ΔG Dimer: primer 간에 결합을 의미하는 것으로 허용될 수 있는 최소한의 값을 설정할 수 있다. 낮을수록 안 좋다.

ΔG Hairpin: primer 자체에서 이루어질 수 있는 결합으로 허용될 수 있는 최소한의 값을 설정할 수 있다. 낮을수록 안 좋다.

이 값들을 변화시키면 찾아지는 primer들의 갯수가 변화하는 것을 볼 수 있다. 가능한 조건을 가혹하게 하는 것이 좋지만 아무 것도 나타나지 않을 수도 있다. 어떤 priemr들은 적절하기는 하지만 너무 가깝게 인접하여 짧은 염기서열이 증폭될 수도 있다. 때문에 적절한 primer를 찾기는 생각보다 수월치 않다. 값들을 변화시키면서 찾아지는 것들을 비교해보라.

3. PCR 반응물의 제조

PCR 반응에는 먼저 실험을 통해서 보았듯이 완충용액을 비롯하여. 많은 반응물들이 필요하다.

(1) primer
주문한 primer들이 도착하면 이것을 TE buffer에 녹여야만 한다.
primer들은 보통 50 nmol 수준으로 합성되며. 건조한 상태로 제공된다
primer들은 0.1~0.5 uM의 수준으로 사용되므로 (100 ul reaction Volume을 기준으로 10~50 pmol의 양) 1 uM에 해당하는 10 X Stock solution을 만들어놓으면 편리하게 사용할 수 있다.
50 nmol에 해당하는 primer 경우 0.5 ml 완충용액에 녹이면 100 uM의 농도에 해당하므로 이것을 1/100으로 희석시키면 10×stock solution이 만들어진다
50 nmol에 해당하는 양은 5만번의 PCR 반응에 사용할 수 있는 아주 많은 양이다.

(2) template DNA
template DNA를 얼마나 사용하면 될 것인가하는 문제는 몰농도를 계산하여 보면 이해할 수 있다.
몰농도는 바로 copy수에 해당한다. Copy 수란 동일한 DNA가 몇 개나 있느냐 하는 것이다.
만약 3 Mb의 길이를 가지는 genomic DNA를 추출하여 1 ug을 사용한다고 가정하면 이 안에는 얼마나 많은 copy수의 DNA가 존재할 것인가?
3 Mb X 660 ≒ 2 X 10¹¹ g
1 ug/2X10¹¹ g ≒ 5 X 10^-18 mol
6 X 10²³ X 5 X 10^-18 = 3 X 10⁶ copies
따라서 1 ug보다 더 적은 1 ng 또는 1 pg만 사용하여도 PCR증폭이 가능하다는 계산이 나온다.
Template를 너무 많이 사용하면 오히려 비특이적인 DNA들이 증폭되는 문제가 발생하기 쉽다.

라. 과제물
   1. 지난 주 과제에서 단백질 정보를 담고 있는 ORF 부위의 서열을 확인하였다. 이것을 증폭하여 pET 벡터에 클로닝하는데 필요한 primer를 고안하라.
       forward primer에는 NdeI 제한효소 인식자리를 삽입하고, reverse primer에는 BamHI 인식서열을 삽입하여 고안하되 30개를 넘으면 안된다. 이것을 벗어나는 경우는 그 이유를 명시하라.
       혹시 위에 명시한 제한효소 자리가 염기서열 내에 위치하는지 여부를 명시하라. 이 경우에는 다른 제한효소를 이용해야 하나 (why?) 여기서는 그대로 진행토록 하겠다.
       고안한 primer쌍의 염기서열을 명시하고, 분석된 Tm 값과 annealing temp을 보고하라.