11장. 효소 촉매
두가지 효소를 예로 들어 효소촉매반응이 어떻게 일어나는지 설명하도록 하겠다.
4. Lysozyme
이 효소는 세균의 세포벽을 파괴하는 효소로서 정확히는 N-acetylmuraic acid와 N-acetylglucosamine 사이의 β(1→4) glycosidic bond를 끊는다 (두가지 당화합물의 구조를 잘 살펴볼 것). 또한 키틴을 구성하는 N-acetylglucosamine 중합체의 β(1→4) glycosidic bond도 끊는다.
A. 효소의 구조
1965년 결정된 X-선 구조는 단백질 표면을 가로지르는 움푹 패인 활성자리를 잘 보여준다. 효소가 어떻게 작용하는지 이해하기 위해서는 효소-기질 복합체의 구조를 아는 것이 중요하다. 그렇지만 기질은 일시적으로 결합하였다가 생성물로 전환되어 떨어져 나오기 때문에 대부분 효소-기질 복합체에 대한 X-선 구조는 저해제나 좋지않은 기질이 이용된다.
Lysozyme의 촉매자리: 천천히 가수분해되는 기질인 (NAG)3를 사용한 X-선 구조분석 결과 그림 11-15a에 그려진 A,B,C 자리에 결합하는 것이 밝혀졌다. 그리고 lysozyme은 6개의 당잔기와 결합할 수 있는 결합자리를 가지고 있음이 모델구축을 통해 밝혀졌다. 그런데 네 번째 잔기 D는 효소에 적절히 결합할 수 없는 것으로 보였다. 이러한 입체장애는 글루코오즈 고리를 정상적인 의자형에서 반의자형으로 바꾸면 없어진다. 이러한 뒤틀림은 D 잔기의 C1, C2, C5, O5 원자들을 동일평면에 놓이게 하여 C6를 정상적인 equatorial 위치에서 axial 상태로 위치하게 만든다. 이렇게 되면 입체장애가 없어지고 Gln57의 뼈대에 있는 carbonyl 기와 수소결합을 이루게 된다. 모델구축을 통해 Philips는 다시 잔기 E와 F가 뒤틀림이 없이 여러개의 수소결합과 반데르발스 접촉을 통해 효소와 결합한다는 것을 알아내었다. 기질의 6개 잔기들이 이루는 수소결합은 그림 11-7에 그려져 있다.
효소의 원래 기질은 매 두 번째 잔기가 NAM이다. 그러나 모델구축에서는 lactoyl 곁사슬은 C 또는 E 위치에는 받아들여지지 않는 것을 보여주었다. 따라서 NAM은 B, D, F에만 결합할 수 있다. Lysozyme이 NAM과 NAG 사이의 β(1→4) 결합을 끊는다는 사실은 잔기 B와 C 또는 D와 E 사이에서 절단이 일어난다는 것을 의미한다. (NAG)3는 B와 C에 걸쳐 있으며, 효소에 의해 절단되지 않는 안정한 기질이기 때문에 절단 자리는 D와 E 사이에 위치해야만 한다. 이러한 예측과 일치하게 실제로 lysozyme은 (NAG)6를 그 환원 말단으로부터 2번째와 3번째 사이를 끊는다. 따라서 lysozyme은 D 잔기의 C1과 O1 사이를 가수분해한다. 더군다나 이 반응은 당결합의 배열을 유지시켜 D-고리 산물은 β anomer이다.
B. 촉매기작
Glu35와 Asp52는 촉매잔기: 이들은 lysozyme의 활성자리에 있으면서 필요한 촉매특성을 가지는 유일한 작용기들이다. 이 잔기들은 절단될 glycosidic 결합의 양쪽에 배치되어 있으며, 매우 다른 환경에 놓여있다. Asp52는 여러개의 극성잔기들로 둘러싸여 수소결합을 이루고 있다. 따라서 Asp52는 정상적인 pK값을 가질 것으로 추정된다. 이 말은 lysozyme이 활성을 가지는 pH 3∼8의 범위에서 이온화 상태로 존재할 것이라는 것이다. 반면에 Glu35의 카르복시기는 비극성잔기들로 둘러싸여 있어 양성자를 가지고 있는 상태로 존재할 것이다. 이 두 잔기의 카르복시기 산소원자들은 기질 D의 C1-O1 결합으로부터 3Å 떨어진 곳에 위치하기 때문에 정전기적, 산 촉매작용에 필요한 후보자로 주목된다. 다른 연구결과도 이러한 추정을 뒷받침하고 있다.
The Phillips mechanism: 위에 열거한 정보에 근거하여 Phillips는 다음과 같은 촉매기작을 제안하였다. 첫째, 효소는 6개의 당 단위로 세균 세포벽에 결합한다. 이 과정에서 잔기 D는 반의자 구조로 뒤틀려진다. 둘째, Glu35는 그 양성자를 잔기 D의 O1에 제공하여 (일반 산촉매에 해당) C1-O1 결합이 끊어지도록 하면서 공명안정화된 C1의 oxonium ion을 만든다. 셋째, 생성된 oxonium ion은 Asp52의 이온화된 카르복시기와의 정전기적 상호작용 (정전기적 촉매에 해당)을 통해 안정화된다. 이들 간의 거리는 C-O 공유결합을 이룰 정도로 가깝지는 않다. 넷째, 효소는 가수분해된 E 고리를 포함한 당을 방출하고 효소에 의해 안정화된 oxonium ion을 형성한다. 이 중간체에 물분자가 더해지면서 Glu35는 양성자화되고 D 고리를 포함한 당들이 떨어져 나간다.
변형 (strain)의 역할: 여러 가지 올리고당들을 사용하여 연구한 결과 D 자리에 결합하는 당잔기를 제외하고는 모두 열역학적으로 선호된다는 것이 밝혀졌다 (표 1). D 자리에 NAM이 결합하는데는 에너지가 요구된다. 이것은 D 고리가 의자구조로부터 반의자 형태로 변형되는데 따르는 에너지를 말하는 것이다. 저해제를 사용한 실험 역시 Phillips 기작을 지지해준다. (NAG)4의 δ-lactone 유사체 (그림 11-21)는 전이상태 유사체이다 (이 화합물의 lactone 고리는 전이상태의 oxonium 이온을 닮은 반의자 구조를 가지고 있다). 예측한대로 X-선 결정구조는 이 저해제가 lysozyme의 ABCD 자리에 결합하여 lactone 고리가 반의자 형태로 D 자리에 결합하는 것을 보여주었다.
그렇지만 이론적인 연구에서 lysozyme은 결합된 기질의 D 잔기를 변형시키기에는 너무 유연하다는 주장이 제기되었다. 실제로 NAG lactone이 D 잔기에 결합하는 친화력은 NAG 보다 9.2 kJ/mol 정도 큰데, 이는 40배 정도의 속도증진에 해당되는 것이다. 이러한 증진효과는 lysozyme의 약 108에 해당하는 속도증진을 설명하기에는 너무 미약하다. 더군다나 N-acteylxylosamine (XylNAc) 잔기 (NAM과 NAG의 입체장애를 야기시키는 6번 탄소의 원자단이 결핍된 것임)는 NAG보다 별로 큰 친화력을 가지지 않는다. 그럼에도 불구하고 Philips 기작은 6번 탄소 원자단의 선호되지 않는 접촉이 D 고리의 변형을 증진시킨다고 가정하고 있다. 이러한 불일치는 Michael James가 밝힌 lysozyme과 NAM-NAG-NAM 복합체의 X-선 구조에 의해 설명되고 있다. 예견한데로 이 3탄당은 효소의 BCD 자리에 결합한다. D 자리에 있는 NAM은 Philips 기작과 일치하게 반의자 형태로 변형되고 그 6번 탄소 원자단은 C 잔기인 NAG의 acetamido 기와의 충돌을 피하기 위해 거의 axial 위치를 가진다. 이러한 변형된 구조는 D 고리의 O6와 Val 109의 뼈대 NH와의 강한 수소결합으로 안정화되어 있다 (전이상태 안정화). 실제로 Val 109를 Pro로 치환시키면 (Pro는 뼈대 NH가 결여되어 있음) 효소는 불활성이다. D 자리에 NAG, NAG lactone, XylNAc가 결합하는데 있어서의 예견되지 않은 적은 에너지 차이는 이들이 D 자리에는 정상적으로 자리잡지 못한다는 것과 변형이 없이도 결합할 수 있다는 사실로 설명된다. 이 자리에 정상적으로 자리잡는 NAM은 변형되지 않은 상태로는 결합을 방해하는 큰 lactyl 기를 가지고 있다. 마지막으로 Glu 35의 카르복시 산소원자는 D 자리 NAM의 O1 원자와 강한 수소결합을 이루고 있다. 이것은 의심할 여지없이 Philips 기작에서 양성자 전달과정을 촉진시킨다. 따라서 Philips 기작은 충분히 정확한 것으로 보인다.
5. Serine proteases
이 단백질분해효소는 Ser 잔기를 포함하는 공통적인 촉매기작을 가지기 때문에 Serine 단백질분해효소로 이름붙여졌다. 이에 해당하는 효소는 거의 모든 생물체에서 소화효소로 존재하며, 그 외에도 발달과정이나 혈액응고, 염증, 등과 같은 다양한 반응에도 관여하고 있다.
이 단백질분해효소들 중 가장 잘 연구된 것이 chymotrypsin, trypsin, elastase들이다. 이들은 췌장에서 합성되는 소화효소로 십이지장으로 분비되며, 각기 다른 기질특이성 (정확히는 절단부위)를 가지고 있다.
A. 활성자리: Ser 195와 His 57 잔기
Chymotrypsin의 촉매작용에 중요한 Ser 잔기는 비가역적 저해제인 DIFP에 의해 밝혀졌다. 이 저해제는 chymotrypsin의 경우 단지 Ser 195하고만 반응한다. 또다른 촉매잔기인 His 57은 affinity labeling을 통해 이루어졌다. 이 방법은 반응기를 가지는 기질유사체가 효소와 안정한 공유결합을 형성케하는 것으로 어떤 촉매잔기가 관여하는지 확인할 수 있다. Chymotrypsin은 TPCK와 반응하는데 이것의 chloromethylketone 기는 강력한 alkylating agent로서 활성자리에서 His 57과 반응하여 효소를 불활성화시킨다.
B. X-선 구조
3가지 효소들은 구조적으로 매우 유사하다. 약 240개의 잔기로 구성된 일차구조는 40% 정도의 상동성을 가지고, 모든 효소는 반응성을 가진 Ser과 His가 존재한다. 단백질 구조는 2개의 도메인으로 구성되어 있으며, 둘다 원통과 같은 역평행 베타판으로 이루어져 있다.
촉매 잔기 His 57과 Ser 195는 기질결합자리에 위치하고 있으며, X-선 구조를 통해 Asp 102가 용액이 접근하기 힘든 움푹팬 곳에 자리잡고 있음이 보여졌다. 3개는 잘 보존된 잔기들로서 촉매삼총사 (catalytic triad)라 불리는 수소결합을 이루고 있는 무리들이다.
기질특이성: X-선 구조는 이 세가지 효소들이 어떻게 다른 기질특이성을 가지는지 제시한다. 1. chymotrypsin에서 Phe, Trp, Tyr의 큰 방향족 아미노산 곁사슬들은 촉매기들 주변에 있는 갈라진 틈의 소수성 자리에 잘 들어맞는다. 2. trypsin에서는 기질결합자리의 안쪽에 Asp (chymotrypsin에서는 Ser189에 해당)가 존재하여 trypsin이 선호하는 기질인 Arg와 Lys을 받아들인다. 3. elastase는 elastin (연결조직에 풍부한 단백질로 Ala, Gly, Val이 많이 존재한다)을 잘 가수분해하는 효소로 그 결합자리는 Val과 Thr에 의해 가려져 있다. 따라서 작은 곁사슬을 가지는 중성 아미노산 (특히 Ala)에 특이적이다. 그렇지만 이러한 잔기들만으로 기질특이성이 결정되는 것은 아니다. 이들 잔기들을 특이적으로 치환시켰을 때도 예상되는 기질특이성은 나타나지 않는다.
Serine protease들간의 진화적인 관계 (방산진화와 수렴진화): 단백질들간의 아미노산 서열과 구조적인 유사성은 진화적인 관계가 있음을 보여준다. 3가지 효소들간의 높은 유사성은 이 단백질들이 공통적인 조상 단백질의 복제와 방산진화에 의해 생겨났음을 가리킨다. 그런데 어떤 serine protease들은 일차구조와 삼차구조가 서로 간에 그리고 chymotrypsin과도 닮지 않았으면서도 활성자리에 촉매삼총사를 가지고 있다. 이들은 Bacillus subtilis로부터 분리된 endopeptidase인 subtilisin과 밀배아의 exopeptidase인 serine carboxypeptidase이다. 그림 11-25에서 보여주듯이 이들의 아미노산 잔기에서 활성잔기들의 순서는 매우 다르기 때문에 공통 조상으로부터 진화하였을 가능성은 매우 희박하다. 이러한 효소들은 독자적으로 생겨나 동일한 촉매활성을 가지는 단백질로 진화한 수렴진화의 좋은 예에 해당한다.
C. 촉매기작
화학적 구조적 자료에 근거한 촉매기작이 chymotrypsin을 예로 그림 11-26에 보여져 있다. 이러한 기작은 모든 serine protease들과 아마도 다른 가수분해효소에도 적용될 것이다.
1. chymotrypsin이 기질과 결합한 후 Ser 195는 절단 peptide의 카르보닐기에 친핵성 공격을 하여 tetrahedral 중간체를 형성한다. 이것은 반응의 전이상태를 닮은 것으로 공유결합 촉매에 해당한다. X-선 연구는 Ser 195가 이러한 친핵성공격을 수행할 수 있는 이상적인 위치에 있다는 것을 보여주었다 (즉, 근접과 배향 효과에 해당). 이러한 친핵성 공격에는 His57의 imidazole 고리에 양성자의 전달이 포함되며 (일반 염기촉매), 이 과정은 His57과 수소결합을 이루고 있는 Asp102의 carboxylate 이온의 극성화효과에 의한 도움을 받는다 (정전기적 촉매). 이러한 tetrahedral 중간체는 일시적으로 존재하지만 잘 밝혀졌다.
2. tetrahedral 중간체는 His57의 N3로부터의 양성자전달에 의해 아실-효소 중간체로 분해된다 (일반 산촉매). 아민 이탈기 (절단된 폴리펩타이드 사슬의 N-말단에 있는 R'NH2)는 효소로부터 방출되고, 용액내의 물분자가 들어오게 된다. 아실-효소 중간체는 가수분해에 매우 취약하다. 그렇지만 낮은 온도하에서 존재하는 중간체를 X-선 구조로 밝힐 수 있었다.
3 & 4. 아실-효소 중간체는 앞단계의 역과정에 의해 아실기가 제거되어 carboxylate 생성물 (절단된 폴리펩타이드의 새로운 카르복시 말단)을 방출하고, 활성을 가진 효소가 재생된다. 이 과정에서 물은 친핵성공격체이고, Ser195는 이탈기이다.
Serine protease들은 전이상태와 잘 결합한다: 여러 가지 serine protease들과 저해제와의 복합체에 대한 X-선 연구를 통해 이들 효소의 촉매기작은 구조적으로 보다 잘 이해되게 되었다.
1. Tetrahedral 중간체를 형성하면서 일어나는 구조적인 변형은 절단 peptide의 음이온 carbonyl 산소로 하여금 활성자리로 더 깊이 들어가 음이온 구멍 (oxyanion hole)이라 불리는 위치를 차지하게 만든다.
2. 음이온 구멍에서는 효소와 두 개의 수소결합이 형성된다.
3. 더군다나 tetrahedral 변형은 효소와 절단 peptide 앞에 있는 잔기의 뼈대 NH 기와의 수소결합을 허용한다.
효소와 기질 또는 아실-효소 중간체에서의 이러한 전이상태 (tetrahedral 중간체)의 우선적인 결합은 촉매효율의 많은 부분을 담당한다. 따라서 촉매삼총사를 이루는 잔기들이 변이된 효소도 ∼5x104 정도의 속도증진활성을 가진다 (정상 효소의 경우 ∼1010 수준). 유사하게 DIPF가 serine protease들의 효과적인 저해제인 이유는 tetrahedral phosphate 기가 이 화합물을 전이상태 유사체로 만들기 때문이다.
Tetrahedral 중간체는 trypsin과 trypsin 저해제의 복합체를 닮았다: 아마도 tetrahedral 중간체에 대한 가장 신뢰성 있는 구조적 증거는 trypsin과 BPTI (bovine pancreatic trypsin inhibitor) 사이의 복합체에 대한 X-선 연구결과일 것이다. 58개의 잔기로 구성된 BPTI는 trypsin의 활성자리에 결합하여 밀접하게 채워진 간격과 수소결합망을 가진 복합체를 형성한다. 이러한 상호작용은 trypsin이 췌장에서 미리 활성화되는 것을 막아준다. 이 복합체의 결합상수는 1013 M-1로서 아마도 단백질-단백질 상호작용 중에서 가장 큰 값에 해당되는 것으로 BPTI의 생리적 중요성을 보여준다. BPTI의 Lys 잔기는 trypsin의 특이성 자리를 차지하고 있고 (그림 11-28a), 저해제의 Lys-Ala 펩타이드 결합은 마치 절단 펩타이드에 해당하는 것처럼 위치해 있다 (11-28b). 이 복합체에서 가장 놀라운 것은 이 구조가 tetrahedral 중간체로 향하는 반응좌표상에 있다는 것이다. Ser 195의 곁사슬 산소는 BPTI의 절단 펩타이드에 있는 카르보닐 탄소와 van der Waals 접촉보다 가깝게 놓여있다 (2.6Å). 그러나 복합체가 이탈기는 떠날 수 없고 물도 반응자리에 들어올 수 없을 정도로 매우 견고하게 밀봉되어 있어 반응은 이 이상 진행될 수 없다.
단백질분해효소 저해제들은 흔하게 존재하며 방어와 조절 기능을 가지고 있다. 어떤 식물은 곤충이 깨물면 단백질저해제를 방출하여 그 소화효소를 불활성으로 만들어버린다. 단백질분해효소 저해제는 혈액단백질의 약 10%를 차지한다. 간에서 분비되는 α1-proteinase inhibitor는 백혈구 elastase를 저해한다. 감소된 활성을 가지는 α1-proteinase inhibitor의 병리학적 변형은 폐기종과 관련되어 있다. 이 질환은 elastic fiber들이 가수분해됨으로써 생기는 폐질환이다. 흡연은 저해제의 활성자리에 있는 Met 잔기를 산화시키기 때문에 흡연자도 이러한 문제를 가진다.
D. Zymogens
단백질가수분해효소들은 보통 보다 크고 불활성인 전구체 상태로 합성된다. Zymogen이라 불리는 proenzyme으로 합성되는 이유는 합성되는 조직의 손상을 방지하기 위해서이다.
Trypsin의 zymogen인 trypsinogen의 활성화는 이것이 췌장으로부터 십이지장으로 들어갈 때 일어난다. Hormone의 조절을 받아 십이지장에서 분비되는 serine protease인 enteropeptidase가 trypsinogen의 Lys15와 Ile16 사이의 peptide 결합을 절단한다 (그림 11-29). 이 절단은 trypsin에 의해서도 일어날 수 있기 때문에 (Why?) 생성된 trypsin은 더많은 trypsinogen을 활성화시키는데 기여하게 된다. 따라서 trypsinogen 활성화는 자가촉매 (autocatalytic)이라고도 한다.
Chymotrypsinogen의 활성화는 2단계로 일어난다. 우선 trypsin에 의해 Arg15와 Ile16 사이의 결합이 절단되어 활성을 가진 π-chymotrypsin이 생성된다. 이것은 다시 자가분해 (autolysis)에 의해 두 개의 peptide가 절단되면서 활성인 α-chymotrypsin이 생성된다. 두 번째 반응의 역할은 알려져있지 않다.
Elastase의 zymogen인 proelastase는 trypsin에 의해 N-말단의 짧은 peptide가 절단되면서 활성화된다. Trypsin은 또한 췌장의 procarboxypeptidase A와 B, 그리고 prophospholipase A2도 활성화시킨다. 때문에 trypsin은 췌장에서 활성화되어서는 안된다. Trypsin inhibitor (BPTI)은 trypsin이 부적절하게 활성화되는 것을 방지하며, 이외에도 다른 기작들이 trypsin의 활성화를 방지한다 (trypsin에 의한 trypsinogen의 활성화는 매우 천천히 진행되는데 그 이유는 아마도 잘 보존된 N-말단의 hexapepide가 큰 음전화를 가지기 때문에 trypsin의 특이성자리에 있는 Asp와 반발한다. 또 한가지는 zymogen은 zymogen granule이라 불리는 단백질가수분해에 저항성을 가지는 세포내 주머니에 저장되어 있다는 것이다).
순차적인 proenzyme 활성화는 다양한 생리적 신호에 반응하여 많은 양의 활성 효소를 신속하게 만들도록 해준다. 예를 들어 혈액응고에 관여하는 serine protease들은 zymogen 상태로 간에서 생성되어 순환하다가 혈관의 손상에 의해 활성화된다 (Box 11-5).
Zymogen들은 변형된 활성자리를 가진다: zymogen들이 촉매잔기들을 모두 가지고 있음에도 활성이 없는 이유는 촉매자리가 활성을 가지는 구조를 이루지 못하기 때문이다.