효소활성 측정

References
1. Fundamentals of enzymology (1981), ed. by N.C. Price & L. Stevens, Chap.2
2. Protein purification: principles and practice (1994), 3rd ed. by Robert K. Scope, Chap.3
3. Biochemistry textbook, enzyme kinetics
4. Biochemical calculations (1975), 2nd ed. by Irwin H. Segel, Chap.5

효소 정제란 생물체내에 존재하는 수많은 단백질 중에서 한가지 원하는 효소 만을 원래의 활성을 가진 상태로 얻어내는 것을 의미한다. 그렇지만 원하는 목적에 따라서는 반드시 활성을 보유한 상태가 아닌 단순히 균질한 상태의 것을 의미할 수도 있다. 효소정제는 산업적인 목적이나, 의약품, 또는 연구 목적에서 매우 중요하다. 산업적인 목적이라면 원치않는 반응을 야기시키는 효소들을 불활성화시킨 정도의 정제로도 소기의 목적을 달성할 수 있다. 그렇지만 의약품으로 사용하는 경우에는 순도가 매우 중요하기 때문에 정제는 필수적이다. 연구목적에도 물론 높은 순도의 정제된 효소가 필요하다. 이 경우 필요한 양은 많지 않으나 최근에는 효소의 구조를 밝히는 것이 보편화되면서 많은 양의 단백질이 얻는 것이 필요해지고 있다.

가. 효소정제의 목적
수많은 다른 종류의 효소나 대사물, 조효소, 또는 염들이 존재하는 상태에서는 어떤 한가지 효소의 작용을 제대로 이해하기가 곤란하다는 것은 자명하다. 따라서 완충용액과 조효소 같은 것 만이 존재하는 가능한 단순한 반응물 내에서 효소에 대한 특성을 분석하는 것이 바람직하다. 간단히 말하자면, 가능한 다른 것들에 의한 간섭효과를 배제하는 것이다. 이렇게 정제된 효소를 통해 효소의 기질 특이성, 반응속도론, 효소활성의 조절과 같은 특성들을 파악함으로써 생체내에서 효소의 기능을 이해할 수 있고, 또는 실용적인 목적으로도 사용할 수 있는 것이다.

나. 효소정제의 목표
효소정제에서 도달코자 하는 목표는 세가지이다: 최대한의 수율, 최대한의 촉매활성, 최대한의 정제도. 즉, 가능한 높은 수율로, 가능한 온전한 상태의 효소를, 가능한 다른 단백질이나 대사물이 배제된 상태로 얻는 것을 의미한다.

효소에 대한 사전 정보: 대부분의 경우 정제하고자 원하는 효소는 전혀 새로운 것일 수가 있다. 이런 경우는 효소와 관련된 사전 정보를 얻는 것이 불가능할지도 모른다. 그렇지만 유사한 또는 연관된 효소들에 대한 자료를 입수하는 것은 매우 중요하다. 이미 어떤 생물체에서 연구된 효소를 다른 생물체에서 정제하고자 하는 경우는 특히 사전정보를 충분히 연구하는 것이 매우 중요하다. 이러한 정보를 통해 효소정제와 관련된 문제를 피할 수 있으며, 다음에 기술된 것과 같은 효소를 정제하는데 실제적으로 필요한 사항들을 검토하여 보다 수월한 방법이나 또는 실험실의 여건에 맞는 방법으로 수정, 보완할 수 있을 것이다.

활성분석 방법의 정립: 원하는 효소의 활성을 얼마나 신속, 간편, 정확하게 측정할 수 있느냐 하는 것은 정제과정 전체를 결정하는 중요한 사항이다. 기존의 알려진 효소의 경우라도 보다 보완할 수 있을 것이며, 새로운 효소라면 적절한 방법을 확립하는 것이 무엇보다 중요하다.

시료의 선택: 시료를 손쉽게 충분히 그리고 값싸게 얻는 것은 매우 중요하다. 때문에 정제하여야 할 대상이 되는 생물체가 정해진 경우라면 선택의 여지가 없으나, 그렇지 않은 경우는 생물체에 따른 효소의 양, 시료 수집의 수월성, 조직 또는 세포내의 분포 등을 검토하여야 할 것이다. 한정된 재료의 경우에도 어떤 분화단계에서 많이 존재하는지 또는 어떤 생장조건에서 많이 발현되는지 등을 사전 분석하여야 하며, 보다 일반적으로는 세포질 내에 존재하는지, 또는 소포내 소기관이나 막에 존재하는 지 등도 알아야 한다.

균질화 방법의 선택: 대부분의 원하는 효소는 세포 내에 존재한다. 따라서 세포를 적절히 파쇄하는 방법을 선택하는 것은 매우 중요하다. 이때 세포가 동물이나 식물 또는 미생물 중 어떤 것에서 유래된 것이냐에 따라 그 방법이 달라진다. 또한 원하는 효소의 불활성화를 방지하고 추출효율을 높이기 위해서는 완충용액의 종류, pH, 염농도, 추가적인 첨가물의 선택 등도 고려되어야 한다.

분리방법의 선택 및 순서의 결정: 분리방법은 크게 단백질로서 효소의 일반적 성질과 효소의 특이적 성질을 이용하는 것이다. 이러한 성질들을 이용한 분리방법은 표1에 열거되어 있다. 효소의 정제는 대부분 이들 중 어느 한가지 만으로 이루어질 수는 없기 때문에 몇가지 방법을 적절히 혼합하여 사용하여야 하며, 어떤 방법을 어떤 순서로 사용하느냐 하는 것은 효소에 따라 다르기 때문에 일반적으로 논의되기가 힘들다. 다만, 어떤 순서로 사용하느냐 하는 문제는 시료의 부피와 시간을 절약하는 차원에서 몇가지 원리가 적용될 수 있다. 일반적으로 용해도의 차이를 이용하는 방법은 큰 부피를 다루어야하는 초기 단계에서 적용하는 것이 바람직하며 전기영동과 같은 방법은 적은 부피를 다루어야하는 최종단계에 적합하다. 친화 크로마토그래피와 같은 방법은 리간드에 대한 효소의 특이적인 결합을 이용하는 매우 강력한 방법이나 모든 효소의 경우에 이용 가능한 것이 아니다. 꼭 필요한 경우는 직접 리간드를 겔에 붙이는 방법을 고려할 수 있다.

정제도의 분석: 정제된 시료가 원하는 효소만이 존재하는 균질한 상태인지를 점검하기 위한 방법으로는 몇가지가 사용되지만 (표2) 대개의 경우는 전기영동 방법으로 충분하다.

이 효소는 adenylate nucleotide들 사이의 반응을 촉매하는 효소로서 거의 모든 생물체에 존재하고 있다.

이 효소의 정제과정은 그림 1에 도식되어 있으며, 각 과정에 대한 분석이 표3에 요약되어 있다. 이 효소의 정제에서 특기할만한 점은 (1) 이 효소는 낮은 염농도에서 추출된다는 것, (2) 낮은 pH에서 안정하다는 것, (3) 세번째 단계의 phosphocellulose chromatography에서 효소에 특이적인 리간드를 이용하여 효소를 용출시킴으로써 높은 수율로 정제될 수 있었다는 것, (4) Sephadex G-75겔 크로마토그래피 (분획범위: 3000-70000)를 이용하여 작은 분자량의 오염된 단백질을 효율적으로 제거할 수 있었다는 것 등이다.

효소의 정제는 생각보다 수월하지 않다. 따라서 정제된 상태의 효소를 충분한 양으로 얻기 위해서는 많은 시간과 노력이 필요하다. 이러한 문제를 극복할 수 있는 대안으로는 원하는 효소의 유전자 또는 cDNA를 적절한 미생물 균주나 조직배양된 세포에서 발현시켜 소위 재조합 효소를 얻어내는 것이다. 이런 경우에도 원하는 유전자를 얻기 위해서는 효소에 대한 정보가 필요하기 때문에 효소정제는 선결되어야 할 과제이다. 다만 이런 경우에는 부분적인 정제나 적은 양으로도 소기의 목적을 달성할 수 있기 때문에 정제과정은 보다 수월해질 수 있다. 한편 최근에는 많은 생물체의 게놈분석이 이루어지고 있어 원하는 유전자를 손쉽게 얻을 수 있기 때문에 유전공학적 방법을 이용한 재조합 효소의 정제는 점차 보편화되고 있다. 플라스미드에 삽입된 유전자는 과발현을 통해 다량 얻을 수 있으며, 소위 꼬리표 (tag)을 붙여서 발현시킴으로써 간편하게 정제될 수 있다 (그림2). 꼬리표는 트롬빈과 같은 기질특이성이 높은 단백질분해효소에 대한 아미노산 서열을 사이에 두고 원하는 효소의 아미노 말단이나 카르복시 말단에 붙여 발현되기 때문에 필요한 경우는 이것을 절단하여 제거할 수 있으며, 또는 아예 꼬리표를 붙이지 않은 상태로 발현시켜도 다량으로 얻어지기 때문에 정제하기가 비교적 용이하다.

신뢰할 수 있는 분석 방법의 개발 (효소의 실제 활성과는 무관)

1. 기질의 농도
    일반적으로 효소활성은 기질의 농도가 높을수록 높다 (그림4).
    기질의 농도를 높게 유지해주어야하는 이유
         시료 조작에서 발생할 수 있는 오차의 범위를 줄일 수 있다
         기질의 소모와 생성물의 증가에 따른 반응속도의 변화를 줄일 수 있다 (표4).

Km과 kcat에 미치는 효과
pH에 따라 효소의 기질에 대한 Km 값은 달라진다.

    완충용액의 성질에 따라 효소활성은 변한다.
         기질과의 경쟁
         금속이온과의 결합

3. stopped method or continuous method
especially important with crude extract
blank (zero-time stop) (그림5)

다. 생성물의 정량분석
      chemical: the most general, separation from substrate
      enzymatic: coupled (or mixed) reaction (그림6), stopped or continuous (표5)
      radiochemical: separation of labeled substrate

라. 조효소추출물의 활성분석
contains sufficient other substrate
interferance by other enzymes of similar activities or competing with substrates

마. 반응물의 혼합
      prepare master mix without substrate: stored or prepared fresh
      preincubation without enzyme at the required temp
      add BSA in case of low protein conc in the mixture

바. 효소활성의 단위 (Units)
대부분의 경우 효소의 실제 농도를 알 수가 없으므로 효소의 양은 그 활성으로 표시된다. 이때 사용되는 단위가 units로서 효소의 농도는 units/ml로 표시된다. 또는 특이활성은 units/mg으로 표시된다. 효소의 활성은 위에서 기술한 바와 같이 기질농도, pH, 이온강도, 온도 등에 영향을 받기 때문에 반드시 반응조건이 명시되어야 한다.