6장. 단백질의 구조와 기능과의 관계

생화학실헙실 웹페이지 (http://home.inje.ac.kr/~biochemi)

단백질의 구조는 기능을 결정한다. 구조와 기능이 어떻게 밀접하게 연관되어 있는 지를 DNA 중합효소를 통해서 살펴보자.

DNA 합성은 살아있는 세포에서 가장 중요하고 복잡한 효소반응이다. 이 반응은 Watson/Crick 염기쌍의 두 DNA 가닥이 주형으로 작용하여 두 개의 동일한 DNA 복사물이 만들어지는 개념적으로는 간단하지만, 수십개의 다른 단백질들이 관여하는 복잡한 반응이다. 이러한 반응들의 중심에는 개개의 뉴클레오티드를 생성되는 사슬에 순차적으로 더해가는 nucleotide polymerase들이 있다.

가. 대장균의 DNA 중합효소 I (Pol I)

      대장균의 DNA 중합효소 I (Pol I)는 첫 번째로 분리된 nucleotide polymerase로서 단일 사슬 내에 DNA 중합, 교정, 수선, 3개의 기능을 가지고 있다. 이 효소의 구조가 단일 폴리펩타이드 사슬 내에서 어떻게 3가지 기능을 가능케 하는지 살펴보도록 하겠다. 3가지 기능에 수반되는 활성들은 다음과 같다.

1. 이 효소는 DNA 주형이 있을 때에만 이미 존재하는 DNA 가닥 (primer 가닥)의 3'-OH 말단에 deoxyribonucleoside 5'-triphosphate들을 붙여준다. DNA 주형은 Watson/Crick 염기쌍을 통해 뉴클레오티드들이 선택되도록 한다. 이 반응의 중요한 특징은 효소가 주형에 붙어있는 상태로 많은 수의 뉴클레오티드들을 붙여주는 것이다.

2. 이 효소의 교정기능은 3'-5' exonuclease 활성에 달려있다. 제거될 뉴클레오티드는 이중나선의 일부분으로 떨어진 상태의 3'-OH를 가지고 있어야만 한다. 이것은 효소로 하여금 늘어나는 가닥의 마지막 뉴클레오티드가 주형과 염기쌍을 이루고 있지 않으면 제거하도록 해준다. 중합효소와 3'-5' exonuclease활성의 통합은 효소로 하여금 실험관에서 주형과 시발체가 주어지면 DNA를 정확히 합성하도록 해준다. 효소가 만약 주형에 맞지않는 부정확한 뉴클레오티드를 첨가하면 그것을 인식하여 3'-5' exonuclease의 활성으로 제거한다.

3. 이 효소는 또한 5'-3' exonuclease 활성도 가지고 있다. 이것은 DNA 사슬이 자라는 앞부분에서 DNA 나 RNA를 제거한다. 절단될 결합은 이중나선 부분에 있어야만 하고 그 활성은 Okazaki 조각의 연결과 DNA 수선에 이용된다.

　

중합효소와 5'-3' exonuclease활성의 통합은 효소로 하여금 오카자키 조각으로부터 RNA 시발체를 제거하게 해준다. 중합효소는 오카자키 조각의 3' 말단에 붙을 수 있다. 5'-3' exonuclease 활성은 앞선 조각의 RNA 시발체에 있는 ribonucleotide들을 잘라내고 그 중합효소활성은 빈 곳을 메운다. 이 과정은 시발체가 제거될 때까지 계속된다.

3가지 활성의 통합은 DNA 중합효소 I이 생체내에서 복구효소로 작용하는 것을 설명해준다. 이중나선 DNA의 어느 한 곳에 절단이 일어나면 이 효소는 절단부위의 양방향으로 뉴클레오티드들을 제거하고 정확한 뉴클레오티드를 채워 넣는다. 마지막으로 새로운 DNA 가닥을 연결하는데는 DNA 연결효소 (DNA ligase)가 요구된다.

이러한 모든 기능들을 하나의 폴리펩타이드 사슬에서 수행할 수 있는 효소는 실제로 화학반응이 일어나는 곳에 활성자리들을 가져야만 한다. 중합효소 반응은 3'-OH가 들어오는 dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate)의 가장 안쪽 (a 위치)에 위치한 인산원자에 대하여 친핵성 공격을 하는 것이다. 이 자리에서 연장된 곳에 시발체와 주형에 대한 결합자리가 있어야만 한다. 이러한 자리들은 효소가 주형을 따라 점진적으로 걸어갈 수 있도록 만들어져 있다. 두 개의 nuclease 활성들에 대한 활성자리는 중합효소 활성자리에 인접하여 떨어진 곳에 있어야만 한다. 구조적, 생화학적, 그리고 유전학적 연구들은 DNA 중합효소 I이 3개의 도메인들을 가지며, 각각은 별도의 효소활성에 관여한다는 결론을 이끌어내었다 (그림 1). 이들 도메인 중 중합효소와 3'-5' exonuclease (Klenow fragment)의 것들에 대한 삼차원구조가 결정되었다.

나. Klenow fragment

       대장균 DNA pol I은 하나의 폴리펩타이드 사슬에 928개의 아미노산으로 이루어진 단백질이다. 이것은 제한된 단백질분해효소 처리에 의해 두개의 조각으로 쉽게 절단된다. 큰 C-말단 조각은 605개의 잔기로 구성되며 코펜하겐의 Hans Klenow에 의해 그 특성이 처음 연구되었기 때문에 Klenow fragment라 불린다 (그림 1). Klenow 절편은 중합효소와 3'-5' exonuclease 활성을 가진다. 작은 N-말단 조각은 단지 5'-3' 활성만을 가진다. 세가지 활성 모두는 각기 다른 도메인에 있으며, 5'-3' exonuclease 도메인은 다른 두개의 도메인의 활성에 영향을 미치지 않으면서 떼어질 수 있다.

Klenow 절편의 폴리펩타이드 사슬은 크고 작은 두개의 구분된 도메인들로 접혀진다. 보다 작은 N-말단 도메인은 잔기 324-517로 이루어지며, 큰 C-말단 도메인은 잔기 518-928로 이루어진다. 그림 2는 폴리펩타이드 사슬의 개요도를 보여준다. 두개의 도메인 사이에는 단지 하나의 공유결합 연결이 있을 뿐이고 접힘에 의한 상호작용은 거의 없다. 따라서 도메인들은 삼차원 구조에서 느슨하게 연결된 상태이다.

1. 큰 도메인은 큰 결합자리를 이루고 중합효소 활성을 가진다
큰 C-말단 도메인은 다른 어떤 구조에서도 발견되지 않은 a + b 부류의 독특한 접힘 모티브를 가진다. 이 도메인의 가장 놀라운 특성은 B-DNA와 결합하기에 충분한 매우 깊은 갈라진 틈 (너비가 20-24 Å, 깊이가 25-35 Å)이 있다는 것이다. 6가닥의 역평행 베타판은 갈라진 틈의 밑을 형성하고 그 주변으로 알파나선들이 크게 돌출되어 있다. 그 도메인은 베타판이 손바닥과 손가락이 마치 막대기를 쥐고 있는 것처럼 배열된 오른손 모양인 것을 상상할 수 있다 (그림 2). 구부러진 손가락들은 몇개의 연이은 알파나선들 (L-Q)로 이루어져 길이 50 Å의 벽을 형성하는 측면을 가리킨다. 다른 벽은 주로 단백질에서 돌출되어 엄지손가락처럼 갈라진 틈을 덮는 두개의 알파나선들 (H, I)에 의해 형성된다. 이 두개의 나선들은 불규칙하거나 유연한 50개의 잔기들로 연결되어 결정에서는 보이지 않았다. 이 유연한 영역의 위치는 틈의 네 번째 벽을 제공하여 손에 쥐고 있는 상상의 막대를 둘러싸게 될 것이다. 역평행 베타판은 원통 구조를 가지는 것이 아니라 그 대신에 열려지고 비틀린 베타판 구조를 이룬다. 판의 한쪽은 열려진 공간과 면하고, 다른 한쪽은 다른 a + b 구조에서처럼 알파나선들과 포개진다.

큰 도메인 내의 큰 공간을 보면 이것이 DNA 시발체의 결합자리로서 중합효소 활성의 활성자리와 관련이 있음을  알아차릴 수 있다. 이 틈은 DNA와 결합할 수 있는 올바른 크기와 특성을 가지고 있다. 이중나선의 B-DNA를 사용한 모델제조에서 이것은 곁사슬들의 미세한 재배열과 돌출된 나선들을 약간 움직이면 잘 들어맞는 것을 보여주었다 (그림 3). 모델은 또한 Klenow 절편의 표면 특성과 일치하고 있다. 이론적인 계산들은 표면에 있는 거의 모든 전하가 열려진 공간 내에 존재하고 DNA의 인산기들과 상보적인 공간에서 나선상의 길을 따르는 것을 보여주었다. 따라서 큰 도메인의 구조는 그 큰 갈라진 틈이 DNA의 시발체와 결합한다는 가설과 일치하고 있다.

큰 도메인 내에 중합효소의 활성자리가 존재하는지에 대한 의문은 C-말단 (잔기 515-928)의 유전자를 따로 클로닝하여 발현시킴으로써 해결되었다. 유전공학이나 온전한 단백질의 적당한 단백질분해로 얻어진 이 부분의 도메인은 중합효소 활성을 가지나 3'-5' exonuclease 활성은 측정되지 않음을 보여줄 수 있었다. 그 외에도 중합반응에 필요한 기질을 표지한 생화학적 실험에서 큰 틈 내의 나선 O에 있는 아미노산 758과 766 (그림 2)이 중합효소 활성자리의 일부분이라는 것을 보여주었다. 결론적으로 DNA 중합활성에 필요한 모든 아미노산들은 Klenow 절편의 큰 도메인 내에 존재한다.

2. 작은 도메인은 하나의 a/b 구조로 이루어지며 3'-5' exonuclease 활성을 가지고 있다.
작은 도메인은 다섯개의 가닥으로 구성된 열려지고 비틀린 혼합된 베타판을 가진 a/b 구조로 접혀진다. 잔기들 330-420은 다섯개의 베타가닥과 두개의 연결 나선들로 이루어진다. 이 나선들은 베타판의 한 쪽을 덮는다. 도메인의 나머지 잔기들은 (421-517) 베타판의 나머지 한 쪽을 덮는 몇 개의 나선들을 형성한다. 중심의 베타가닥은 다른 네 개의 평행가닥들에 역평행이다.

결정구조는 dNMP가 작은 도메인에 결합한다는 것을 보여주었다. dNMP는 3'-5' exonuclease 반응을 저해하므로 (추측컨데 생성물 저해에 의해) dNMP 결합자리는 3'-5' exonuclease 반응에서 공격받는 자라나는 DNA 사슬의 3' 말단 위치와 일치한다고 추정되었다. 이러한 가정은 그러나 중합과 exonuclease 활성자리들이 멀리 떨어져있는 것을 의미한다 (그림 4). 큰 도메인의 중합 활성자리와 작은 도메인의 exonuclease 결합자리 사이의 거리는 실제로 약 30 Å이다. 이러한 설명이 맞는지 여부가 유전적인 실험을 통해 이루어졌다. dNMP 결합자리는 두개의 결합된 2가 금속이온을 포함하고 있다. 금속이온과 결합하는 Asp와 Glu를 Ala로 바꾼 두개의 돌연변이체를 만든 결과 둘 다 중합활성은 있었지만 exonuclease 활성은 없었다. 이들 돌연변이체에 대한 결정 연구는 도메인 구조들이 모두 망가지지 않았음을 보여주었다. 결론적으로 이 실험들은 dNMP 결합자리가 exonuclease 활성과 연관되어 있으며 exonuclease 활성자리는 중합활성자리와는 구분되어 있음을 보여주었다.

다. DNA 합성은 어떻게 충실하고 빠르게 진행되는가?

         Klenow 절편에 대한 구조적 유전적 분석으로 빠른 진행 (어떻게 여러개의 뉴클레오티드들이 효소가 DNA와 결합할 때마다 들어가는가)과 충실도 (어떻게 잘못 연결된 염기쌍들이 교정되는가)의 기작에 대한 예측이 가능하게 되었다. 빠른 진행은 각 단계 사이에 해리를 막을 수 있는 단단한 DNA-효소 복합체를 요구할 뿐만 아니라 효소와 주형 DNA 사이의 손쉬운 이동을 필요로 한다. 왜냐하면 동일한 활성자리가 자라나는 시발체 사슬에 뉴클레오티드를 매번 계속 붙이는데 사용되기 때문이다. DNA가 결합하면 그림 3에 표시된 것처럼 나선 H와 I 사이의 유연한 영역 (그림 2)이 결합 공간의 위를 가로질러 접혀 단백질이 완전히 DNA를 감싸는 것으로 추정된다. 이러한 상호작용은 이동에 따른 DNA의 해리속도를 감소시켜 빠른 진행과 더불어 복합체 내로 더 많은 뉴클레오티드들이 첨가되는데 기여할 것이다.
         어떻게 이동이 쉽게 일어날 수 있을까? 효소가 B-DNA와 복합체를 이룬 모델에서 알파나선들 J와 K는 (그림 2) DNA의 큰 홈에 부분적으로 위치하여 단백질에 대해 DNA 큰 홈이 정확히 위치하도록 너트의 선과 같은 기능을 하는 것으로 추정된다. 따라서 DNA 합성이 진행되는 동안 중합효소는 DNA를 따라 나선상의 길로 움직일 것이다. (DNA를 볼트, 효소의 공간을 너트로 상상해보라)
         교정 과정에서는 다른 형태의 이동이 일어날지 모른다. 만약 중합활성자리에서 뉴클레오티드가 잘못 연결되면 DNA는 단백질에 대해 30 Å 움직여 잘못 연결된 염기쌍을 3'-5' exonuclease 교정 자리로 옮긴다 (그림 4). 구조적인 견지에서 단백질의 구조적 변화가 두개의 활성자리를 함께하도록 옮기기는 불가능하다. 그러므로 단백질과 DNA 간의 상대적인 이동이 일어나야만 한다. 단백질에 대해 30 Å 움직이는 것을 설명하기 위해서는 잘못 연결된 염기쌍이 활성자리에 의해 인식되면 DNA가 미끄러져 최소한 8개의 염기쌍 (3.4 x 8 = 27.2)에 해당되는 많은 거리를 움직이도록 유도된다고 제안되었다. 그러한 기작은 만약 잘못된 염기가 삽입되면 이동과정이 늦추어지거나 없어지고 잘못된 염기쌍이 3'-5' exonuclease 활성자리에 도달하면 미끄러짐이 멈추어질 것을 요구한다.

라. 다른 중합효소와의 진화적인 연관관계

      아미노산 서열상의 상동성을 분석하면 대장균 DNA pol III의 e 단위체와 박테리오파아지 T7 중합효소 둘 다는 Klenow 절편에 서열상의 유사성을 보여주지만 진핵 DNA 중합효소와는 상동성이 없었다.

대장균 DNA pol III는 여러 개의 다른 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 복합 효소이다. 3'-5' exonuclease활성은 이 사슬 중 하나로서 Klenow 절편의 작은 도메인에 상당한 서열 상동성을 보이는 작은 e 단위체에 위치한다. 상동 영역들은 뉴클레오티드와 상호작용하는 잔기들을 비롯하여 저해제 결합자리를 포함하고 있다. 대장균 Pol III 의 경우는 효소의 도메인들은 유전자 수준에서 분리되어 있다. 그러나 기능은 번역 후 폴리펩타이드 사슬들이 비공유결합으로 뭉치면서 합쳐진다. Pol I은 모든 도메인들이 유전자 융합에 의해 함께 있는 것이다.
(DNA pol III의 그림, DNA pol III에 의한 복제기작)

박테리오파아지 T7 DNA pol은 흥미로운 효소이다. 이것은 파아지의 유전자 5의 산물로서 이 유전자에 의한 폴리펩타이드 사슬은 중합활성과 exonuclease 활성 둘 다를 가진다. 그러나 파아지 유전자산물은 숙주의 단백질인 대장균의 thioredoxin과 합쳐져야만 활성을 가진다. T7 DNA pol의 구조는 아직 밝혀지지 않았으나 그 중합활성 도메인은 Klenow 절편의 중합활성 도메인과 구조적으로 유사하다고 믿고 있다. 이렇게 믿는 이유는 두개의 도메인 사이에 유사성이 매우 높다는 것이다. 9에서 45개의 잔기들에 이르는 서열의 여러 절편들이 상동적이며 이러한 상동 절편들 8개는 Klenow 절편 내의 유연한 준도메인을 비롯하여 DNA 결합 틈을 형성하는 구조의 대부분을 이루고 있다 (그림 5). 그림에서 상동성인 부분은 붉은 색으로 표시되어 있다. 두 단백질에서 상동 절편들 사이의 영역들은 길이가 매우 다르다. Klenow 절편에서 이들은 도메인 구조의 표면으로 벗어나는 부분에 해당되어 이 부분에서의 결실이나 삽입은 문제를 일으키지 않을 것이라고 짐작할 수 있다.

Klenow 절편과 T7 DNA pol의 중합효소 도메인들 사이의 높은 상동성은 두 효소가 공통적인 전구체로부터 진화하였다는 것을 의미한다. 어쩌면 파아지가 진화과정의 어떤 단계에서 세균 효소를 취득하게 되었을 지 모른다. 모든 DNA pol에서 주형으로부터 DNA를 복제하는 도메인들이 과연 공통적인 조상으로부터 진화하였는 지는 의문으로 남아있다. 만약 공통적인 조상이 있었다면 진핵과 원핵 중합효소들은 이제는 서열상의 상동성을 잃어버릴 정도로 분기되었음에 틀림없다.

마. 단백질들은 모듈로 구성된다.

      앞장에서 단백질 분자들이 자주 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 함께 연결된 모듈들로부터 만들어졌다는 중요한 원리를 보았다. 개개의 모듈은 특정한 기능을 맡는 하나의 도메인으로 접혀진다. (모듈이란 도메인을 형성하는 특정 아미노산 서열을 가리키는 말로 도메인은 구조를 가리키는 용어인데 반하여 기능적인 의미의 용어에 해당된다. 하나의 모듈은 하나의 도메인을 의미한다). DNA 중합효소들도 이러한 원리의 뚜렷한 보기를 제공한다. 대장균 DNA pol I에는 하나의 폴리펩타이드 사슬에 각기 다른 기능을 가지는 3개의 모듈이 있다 (그림 6): 5'-3' exonuclease, polymerase, 그리고 3'-5' exonuclease. 이 효소의 유전자는 각기 다른 모듈을 암호화하는 3개의 유전자의 융합된 산물로서 동일한 operator 영역에 의해 동시적으로 조절되는 것으로 추정된다. 다른 것에서도 이런 기능들 중 어떤 것이 분리되었거나 또는 결실된 것을 보게 된다. T7 박테리오파아지의 DNA pol의 유전자에서 5'-3' exonuclease 활성의 모듈은 한 폴리펩타이드 사슬에 있고, 다른 활성은 두번째 사슬에 있다. 활성을 가진 효소는 이 두개의 사슬이 비공유결합을 이룬 복합체이다. 이 경우 모듈들은 유전자 수준에서는 분리되어 있으나 기능들은 합쳐져 있다.