Rasmol 사용법

6. 단백질 삼차원 구조의 관찰과 분석

1. 목표: 단백질의 입체구조를 컴퓨터 프로그램을 통하여 관찰하고 분석하는 방법을 배움으로써 단백질 구조에 대한 이해를 도모한다.

2. 내용: 현재 많은 단백질의 입체구조가 NMR이나 X-선 회절분석을 통해 밝혀졌으며, 계속 규명되고 있다. 구조는 그 기능을 이해하는데 큰 도움을 준다. 단백질에 존재하는 각 원자들은 공간 상의 x, y, z 좌표로서 표시되는 ***.pdb 파일로 저장되어 컴퓨터 프로그램을 통해 그 구조를 모니터에 전개시켜 관찰할 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램에는 rasmol, chime, protein explorer 등이 있다. Chime은 웹 상에서 구조를 보고자 할 때 사용되며, rasmol은 개인 컴퓨터에 저장된 pdb 파일의 단백질 구조를 보는데 사용된다. Chime은 마우스 만을 사용하는 장점이 있지만, rasmol은 명령어를 타이핑해야 한다. 개인 컴퓨터에서 사용하기는 rasmol이 편리하고 사용원리는 프로그램에 상관없이 비슷하다. 여기서는 rasmol을 사용하여 단백질 구조를 관찰하는 방법에 대하여 배우도록 하겠다.

3. 실습: Rasmol 사용법
Rasmol은 분자의 3차원 구조를 보여주는 컴퓨터 프로그램이다. Rasmol 명칭은 raster display of molecules에서 유래하였으며 raster란 컴퓨터 전개방식 중 하나이다. 이 프로그램은 영국 Edinburgh 대학의 Roger A. Sayle가 학위과정의 일환으로 Glaxo의 지원을 받아 개발한 프로그램이다. 여기서 사용하는 교재는 영국 Edinburgh 대학의 Andrew Coulson에 의해 만들어진 원본 (영어 교재)에서 일부를 발췌하였다. 세가지 단백질 (RNAse, myoglobin, cro)을 중심으로 이차구조의 주요 부분들을 어떻게 인식할 수 있는지 설명하도록 하겠다. Rasmol homepage에 접속하면 보다 많은 정보를 얻을 수 있다.

우선 하드 드라이브에 rasmol 디렉토리를 만들고 rasmol 소프트웨어 (raswin.exe)를 받아 저장한다. 이 프로그램에 사용할 수 있는 구조화일들은 pdb의 확장명을 가진 것들로 앞서 배운 NCBI site를 비롯하여 여러 곳에서 다운 받을 수 있다. 우선 rasmol 실행화일을 작동시키면 검은 바탕의 화면이 나타난다. File을 클릭한 후 Open에서 저장된 pdb 파일을 지정하면 그림이 나타난다. 이제부터 이 그림을 어떻게 살펴볼 것인지 알아보자.

모든 단백질은 개개의 독립적인 구조를 가지지만 그 구조를 분석해보면 유사한 유형별로 묶을 수 있으며 이들을 체계적으로 구분해놓은 곳이 SCOP (Structural Classification Of Proteins) site이다. 다음 표에서 보듯이 지금까지 밝혀진 구조는 모두 21529개 이지만 이들은 같은 유형별로 구분되었을 때 1212개의 family로 구분될 수 있고, 최종적으로는 7개의 class들로 구분될 수 있다. 여기서는 family란 서열, 구조, 기능상의 유사성을 가지는 것들을 묶은 것으로 진화적으로 연관된 것들이고, 이들을 다시 서열상의 유사성은 낮지만 공통적인 구조와 기능을 가지는 것들로 묶은 것이 superfamily에 해당된다 (교과서에 147 page에 나오는 c-type cytochrome들을 상기하라).
Superfamily에 해당되는 것들 중에 그 중심적인 부분에서 공통적인 folding topology를 가지는 것들끼리 구분한 것이 fold에 해당된다. 이들을 다시 구분한 것이 class로서 α, β, α+β, α/β, multidomain protein, membrane proteins, small proteins에 해당되는 것들이다. SCOP에 들어가 cytochrome을 찾아보면 아래와 같은 분류체계를 볼 수 있다.

hierarchy	number (2000/01/01 현재)	example
classes	7	α
folds	520	cytochrome c
superfamilies	771	cytochrome c
families	1212	monodomain cytochrome c N-terminal (heme c) domain of cytochrome cd1-nitrite reductase Cytochrome bc1 domain, and two more families
domains	21529	cytochrome c6, and nine more domains

가. Molecular Graphics Program, RasMol

다음 메뉴들을 마우스를 사용하여 열어보자.

1. Display 메뉴

(1) Space-filling model: 가장 사실적인 모델로서 각 원자를 완전한 구형으로 보여준다. 이때 수소원자들은 제외되므로 다른 원자들의 크기는 약간 과장되어 있다.

(2) Ball-and-stick model: 구조 내부를 볼 수 있게 해준다. 원자들은 작은 구들로 표시되고 그들간의 결합은 막대로 표시된다.

(3) Wireframe model: 원자들은 wire로 표시된 결합들이 만나는 곳까지 줄어든다.

(4) Backbone model: 모든 곁사슬들은 제거되고 폴리펩타이드의 접힘은 알파탄소들의 중심을 연결하는 직선 상의 막대들로 나타난다.

(5) Smooth ribbon model: 가장 단순한 것으로 리본이나 가닥으로 펩타이드 단위가 그려져 있다.

전개도 상의 그림들은 x, y, z 축으로 회전되기 때문에 분자의 모든 부분을 살펴볼 수 있으며, shift 키를 누르고 마우스를 조작하면 크기도 확대, 축소될 수 있다.

2. 색깔

(1) CPK: 가장 일반적인 방법으로 탄소원자는 연회색, 산소는 적색, 질소는 청색,황은 노란색이다.
(2) Group: 사슬의 말단은 청색에서부터 C-말단은 적색까지 무지개색으로 표시되어 있다.
(3) Shape: 뼈대는 연회색, 곁사슬 원자들은 크기와 극성에 따라 다음과 같은 색으로 구분되어 있다.

amino acid residue	Shape
A	pale green
G	white
D	dark magenta
E	red
K	royal blue
R	navy blue
C	sandy yellow
M	pale brown
H	slate blue
Q	flesh pink
N	salmon
S	tomato
T	orange red
P	grey
I	dark green
L	grey
V	pale magenta
W	yellow
F	grey
Y	clay grey

이 프로그램은 마우스와 함께 Comman 창을 사용한다. Command 창을 열려면 왼쪽 Shift 키를 누르고 Alt 키를 반복하여 두드린다. 하단에 상황선에서 창이 열린 것을 확인한다.

Action	Windows
Rotate X,Y	Left
Translate X,Y	Right
Rotate Z	Shift-Right
Zoom	Shift-Left
Slab Plane	Ctrl-Left

나. Ribonuclease
5rsa.pdb 파일을 열면 wireframe 영상이 나타난다. 또는 command에서 load 5rsa.pdb를 타이핑하여도 된다. Display 메뉴에서 Spacefill을 선택한다. "Options"를 열고 "Hydrogens"를 선택하면 수소원자들이 사라진다. 몇 개의 물분자들이 보이는 것을 알 수 있다. 이것들은 결정구조에 고정된 것이다. 이것을 제거하려면 command에서 다음을 타이핑한다.

          select DOD
       spacefill off
       select amino

표면에 현저하게 움푹 패인 곳과 그림 중간 쯤에 phosphate 이온 (orange and red)이 결합된 것을 볼 수 있다. 오른 쪽에는 His 잔기의 5각형 고리를 볼 수 있다. 이들 원자들 중 하나를 클릭하면 His-119 임을 보여준다. 이것은 활성자리에 있는 두 개의 His 중 하나이다. 나머지 하나는 인산기에 숨겨져 있다. 이것을 보려면

          select [PO4]
        spacefill off
        select amino

이제 His-12를 볼 수 있을 것이다. 구분이 안가면 Display 메뉴에서 Stick으로 바꾼다.

다음과 같은 명령어를 타이핑하면 구조를 절단하여 볼 수 있다.

slab 70

이것은 상부 30%가 제거된 그림이다. 이런 방식으로 다른 값들을 시도해 보아라. His-12와 His-119가 가장 잘 보이는 값은 얼마인가 ?
"ssbonds on"을 타이핑하면 이황화가교를 볼 수 있다. 다시 select Cys를 타이핑하고 모양과 색깔을 바꾸면 이것들로 연결된 8개의 cystein 잔기들을 볼 수 있다. 다음 명령어를 타이핑하면 다시 전체를 볼 수 있다.

slab off

색깔을 Group으로 바꾸고 Display를 Ball-and-Stick, Wireframe, Backbone, Ribbons으로 바꾸면서 그림을 살펴보자. Ribbon 상태에서 마우스를 움직여 이차구조들을 살펴보자.
이 그림에서 활성자리에 있는 두 개의 His 잔기들을 잘 볼 수 있다. 다음 명령어를 타이핑한다.

         select (his12 or his119) and sidechain
         wireframe 200 (이 수치는 바꾸면 크기를 조절할 수 있으며, 다른 보기 방식의 경우에도 동일하게 적용된다. 가령 spacefill 100으로 명령할 수도 있다)
         color atoms red

His-12와 His-119 각각은 어떤 이차구조에 존재하는지 알아볼 수 있다.
이제 다른 구조를 보려면 zap을 타이핑한다.

다. Helix proteins: b562 and myoglobin
Myoglobin은 alpha protein로서 알파나선이 주가 되는 구조를 가진다.

myoglobin (1mbn.pdb)을 열어보자. 이것은 헴을 함유하고 있으며 말단조직에서 산소를 전달 단백질로서 헤모글로빈의 단위체들과 매우 유사하다.

다음 명령어를 타이핑하면 Wireframe 그림에서 바닥의 중심에서 흰색으로 보이던 헴 group이 빨간색으로 잘 드러날 것이다.
select hem
color red

메뉴의 Display에서 Spacefill을 선택하면 헴 만이 빨간 색의 spacefill로 보일 것이다.

그림을 회전시켜 헴이 상단 중앙에 수직으로 위치하도록 만든다. 다시 select all 을 타이핑하고 그림을 Spacefill로 바꾼 후 색깔을 Shapely로 만든다. 헴의 색깔은 핑크로 바뀐다.

Choose 'Options' 에서 'Het Atoms'을 클릭하면 헴이 사라지면서 헴결합 포켓을 볼 수 있다.

Choose 'Options' 에서 'Shadows'를 선택하면 헴과 접촉하는 잔기들을 보다 잘 볼 수 있다.

그림을 backbone으로 바꾸고 group 색깔을 선택하면 알파나선들을 볼 수 있다. 나선들의 수를 세어보고 어떤 나선이 헴 결합자리를 형성하는지 확인하라.

다음 명령을 입력하고

backbone off

select resno>57 and resno<79

Display를 backbone으로 선택하면 나선 하나의 그림을 볼 수 있다. 다시 spheres로 바꾸어 색깔을 shapely로 선택한다. 그리고 다음 명령을 입력한다.

select all
backbone on

Spacefill로 보여진 나선에서 아미노산 잔기들의 위치를 확인하라. 어떤 아미노산 종류가 파묻힌 위치에 있는지 볼 수 있다.

다. DNA binding protein

3cro.pdb는 Cro 단백질이 DNA와 결합된 구조를 보여준다.
select dna를 타이핑하면 DNA 만이 선택되고, select protein을 타이핑하면 단백질 만이 선택된다. DNA와 단백질을 각각 다른 형태로 바꾸면 결합된 구조를 보다 잘 이해할 수 있다.
Cro 단백질의 특이적인 아미노산 잔기들을 볼 수 있다. "set ambient 0~100"를 타이핑하면 거리에 따라 빛의 강도가 달라져 원근감을 살릴 수도 있다.

라. 과제물

1. 각 조별로 NCBI site 에 들어가 구조가 밝혀진 단백질 파일을 하나씩 불러들여 그 구조를 관찰한다.
(우선 앞서 과제물로 처리한 효소나 단백질을 찾아보고, 없는 경우에는 지금까지 교과서에서 배운 단백질 중에 하나를 찾아보도록 한다)
2. 이 구조들을 rasmol을 이용하여 strand 모양으로 전개하고, 색깔을 structures로 바꾼다. Asp와 Glu 잔기들을 찾아 ball & stick으로 전환시키고 색깔을 녹색으로 표시하라. Val과 Trp 잔기들을 찾아 ball & stick으로 바꾸고 색깔을 빨간색으로 표시하라.
3. 이황화가교 (disulfide bond)를 찾고 이 결합에 관여하는 Cys 잔기들이 잘 보이도록 조치하라. 없는 경우에도 Cys 잔기들을 찾아 보여준다.
4. 중앙에 위치한 아미노산 잔기를 찾는다 (가령 전체 아미노산 잔기가 180개라면 select 90을 타이핑하면 된다). Spacefill로 바꾸되 크기를 조절하고, 색깔은 노란색을 부여한다. 이것이 어떤 아미노산 인지 명시하라 (마우스를 대고 클릭하면 다른 창에 아미노산 명칭이 나타난다).
5. 단백질과 결합된 ligand들을 보기 위해서는 앞서 myoglobin에서처럼 그 명칭을 부여해야만 한다 (pdb 파일을 열어보면 알 수 있다). 이것을 모를 경우는 "select hetero"를 타이핑하면 찾아진다 (간혹 단백질 주변의 물분자가 함께 보여지기도 한다). 다른 구조와 색깔로 바꾸어 존재 유무를 확인하라.
6. 마지막으로 "set background white"를 타이핑하면 화면이 하얀색 바탕으로 바뀐다. 그림을 저장하려면 메뉴 Export를 클릭하여 bmp 나 gif를 클릭하여 파일명을 부여한다.
7. 저장한 그림을 워드프로세서에서 불러들여 레포트로 제출한다. 이때 단백질 구조에서 초이차구조 (motif)나 도메인 구조에 해당되는 부분이 있는지 확인하고, 그 부위를 표시하라. 가능한 위에 열거한 내용들을 쉽게 볼 수 있도록 정리된 것을 제출한다. 가령 맨 상단에는 단백질의 명칭, pdb 파일의 명칭, 아미노산 잔기의 갯수, 이황화가교의 존재유무, 중앙에 위치한 잔기의 명칭, ligand의 존재유무와 명칭 등으로 정리하고, 그림을 함께 보여준다.

다음 내용은 과제물은 아니지만 필히 기술하기 바람.

7. 지금까지 6주간에 걸쳐 배운 내용들이 유익하였다면 어떤 점에서 그러했는지 구체적으로 기술하고, 유익하지 않았다면 무엇이 문제인지를 기술하라. 보완해야할 필요가 있었다면 어떤 것인지도 기술하라.