Phylogenetic analysis and comparative genomics

(by James A. Lake and Jonathan E. Moore)

분자서열분석은 계통수분석과 비교게놈학에 중요한 분야로서 진화하고 있다. 아직은 초기단계지만 그 중요성이 증가하고 있는 이 분야의 함정과 실제적인 해결에 관해서 기술코자 한다.

대개 계통수 (phylogenetic tree)가 무엇인지 알고있지만 자주 계통수에 응용되는 두가지 특별한 개념이 있다. 이것들은 rooted 와 unrooted tree의 개념이다. Rooted tree가 다소 계통수에 대한 대부분의 생각에 부합될 것이다. 전형적으로 생물체들이나 유전자들의 원시적인 형태는 tree의 바닥에 보여진다. 그리고 tree는 그 꼭대기의 마지막 가지에 이를 때까지 가지를 치거나 갈라진다. 이 관례에서 벗어나는 것은 없지만 tree는 정점이 밑이나, 왼쪽 또는 오른쪽, 어느 곳에도 위치할 수 있다. Unrooted tree는 덜 직관적이며 보다 추상적인 개념이다. Unrooted tree들은 가지치는 순서를 나타내나 최종의 공통적인 조상의 뿌리나 위치를 가리키지는 않는다. 이상적으로는 rooted tree가 낳다. 그러나 실제에 있어서는 거의 모든 계통재구성 (phylogenetic reconstruction) algorithm은 unrooted tree를 제공한다. 따라서 이들에 대해 알아야할 필요가 있다.

Pitfalls of comparative genomics

일반적으로 분자서열분석이 초기단계라고는 인식되지 않는다. 이것은 일반적인 수학적 통계학적 원리들에 근거한 분석도구들이 거의 없는 부정확한 과학이다. 결과적으로 많은 (아마도 대부분) 분자서열들로부터 재구성된 계통수들은 부정확하고 자주 상식적인 것과 상충한다. 이것은 주로 서열분석에서 3가지 함정 중 어느 하나 또는 그 이상에 근거한다: (1) 부정확한 수학적 모델들과 세가지 이상의 분류군을 배열하기 위해 사용되는 progressive alignment algorithm들에 의해 맞들어지는 편향과 특히 연관되어 있다; (2) site-to-site 변이 (서열들 내의 모든 site들은 다른 속도로 진화할 수 있다)를 적절히 설명할 수 없는 문제; (3) 불균등 속도효과 (tree 내의 다른 분류군의 유전자들이 다른 속도로 진화할 때 대부분의 tree-building algorithm들이 좋은 계통수를 만들 수 없는). 이 세가지 함정들은 동일한 인위적인 결과로 long branch attraction을 낳는다.

이러한 인위적으로 생성된 tree들에서 빠르게 진화하는 서열들 (계통수에서 긴 가지로 나타나는)은 비록 거리가 멀더라도 다른 빠르게 진화하는 서열들과 함께 위치할 것이다. 더많은 자료를 수집하여 해결할 수 있는 분자생물학에서의 대부분의 문제들과 비교해보면 long branch attraction은 훨씬 복잡하다. 이 문제가 발생할 때 만약 보다 긴 서열들이 사용된다면 부정확한 해결은 좀더 강력히 지지될 수 있다. 세가지 함정 중에서 alignment artifact가 가장 심각하다. 왜냐하면 두 번째와 세 번째 문제가 해결되도 misalignment는 계속 부정확한 tree을 만들어내기 때문이다. 새로운 algorithm인 paralinear (logdet) distances는 세 번째 문제에 대해 간단하면서도 정밀한 수학적 해결을 제공해준다. 이 특별한 algorithm은 아래에 기술된 계통수 package들중 몇가지에서 이용가능하다. Maximum parsimony, maximum likelihood, 그리고 다른 distance method에 대해서는 Stewart의 논문 (1993, Nature 361, 603-607)을 참조하라.

Practical suggestions

최근까지도 인식되지은 않고 있지만 long branch artifact들은 매우 흔하다. 그러나 몇가지를 주의하면 그 빈도를 줄일 수 있다. 첫째, 항상 계통수를 계산하기 전에 배열된 서열을 분석하라. 만약 배열들이 많은 gap들을 가지고 있다면 매우 분기된 서열들이 포함되어 있음을 가리키는 것으로 그 배열은 부정확할 지 모른다. 이런 경우는 결과들을 매우 주의깊게 살펴야만 한다. Gap들이 모든 서열들에서 야기되었는지 또는 하나나 몇가지 차이가 있는 서열들에서 비롯되었는지 점검하여야할 것이다. 후자라면 그 서열을 제거해야만 한다.

두 번째, 만약 어떤 서열이 계통수에 꼭 포함되어야함에도 잘 배열되지 않는다면 가깝지만 보다 천천히 진화하는 종으로부터 동일한 유전자 서열을 얻는 것을 고려하라.

마지막으로 연구되는 tree가 다른 유전자들의 tree들과 상충되는지를 조사하라. 만약 보다 느리게 진화하는 것처럼 보이는 다른 유전자가 다른 tree를 보여준다면 아마도 long branch attraction이 문제를 야기시키는 것이다. 그런 경우 세 번째 유전자를 고려해보아라.

How do you know if the results are statistically siginificant?

Bootstrapping은 tree 내의 개개의 가지들의 통계적인 중요성을 평가하는데 자주 사용되는 과정이다. 그럼에도 이것이 무엇이고 어떻게 결과들을 해석하는지를 정확히 모르는 사람들이 많다. 첫째, sampling with replacement의 개념을 이해하는 것이 필요하다. 이것은 호수에 있는 물고기의 수를 그들 중 몇 개를 수집하여 꼬리표를 붙이고 방류하였다가 몇 주 후에 그 과정을 되풀이하여 꼬리표가 달린 물고기의 비율을 측정함으로써 계산하고자 하는 것과 연관된다. 앞서 표지된 고기들의 비율을 알면 호수 내에 존재하는 전체 물고기의 수를 계산할 수 있다. Bootstrapping는 배열된 서열들의 세트를 사용하여 서열이 무한히 길다면 어떤 것일 수가 있는지를 계산하는 것이다. 이 경우 배열에서의 각 열 (referred to as a sequence pattern)은 고기의 역할을 하고 sampling with replacement는 인위적인 서열배열들의 수 (보통 100)를 만들기 위해 사용된다. Tree들은 이들 각각으로부터 계산되고 이들 tree 내에서 여러 가지 가지치기 유형들이 관찰되는 빈도가 기록된다. 만약 특정한 가지치기 유형이 70%로 관찰된다면 이 가지치기 유형은 70%의 bootstrap support를 받는다고 일컬어진다. Bootstrap 결과들의 정확한 통계학적 해석은 아직까지도 연구의 대상이나 □rule of thumb'는 70% 이상의 bootstrap support를 받는 내부의 tree branch들은 95% 수준의 정확성을 가지는 것으로 지지된다. (그렇다해도 높은 bootstrap %는 long branch attraction들이 결과를 왜곡시키지 않았다는 것을 보장하지는 않는다).

The Programs

게놈자료들로부터 tree들의 계산을 돕는 여러 가지 훌륭한 프로그램들이 있다. 이들 프로그램에 대해 더많은 정보를 제공하는 Web site의 주소들은 URLs box에 표기되어 있다. Reconstructing tree들을 위한 가장 잘 알려진 소프트웨어는 PAUP (phylogenetic analysis using parsimony)이다. PAUP는 paralinear distance (logdet) 분석들을 실시하여 세번째 문제점이 없는 결과를 내놓는다. 이외에도 PHYLIP, Hennig86, MEGA/METREE, GAMBIT, MacClade 등이 있다.

URLs
PAUP	http://onyx.si.edu/PAUP/
GCG package	http://www.gcg.com/
PHYLIP	http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
Hennig86	http://www.vims.edu/~mes/hennig/software.html
MEGA/METREE	http://www.bio.psu.edu/faculty/nei/imeg
GAMBIT	http://www.lifesci.ucla.edu/mcdbio/Faculty/Lake/Research/Programs/
MacClade	http://phylogeny.arizona.edu/macclade/macclade.html

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