Protein classification and functional assignment

(by Kay Hofmann)

특정한 구조나 기능적인 요소들을 가리키는 아미노산 서열 모티브들의 여러 가지 집단들이 존재한다. 새로 확인된 서열을 가지고 이러한 집단들에 대한 Web-based 검색을 실시하면 타당성있는 기능적 예측을 할 수 있다.

다양한 게놈과 cDNA 서열분석 사업들이 놀라운 속도로 새로운 서열자료들을 방출하고 있어 이들에 대한 대규모의 기능적 분류가 필요해지고 있다. 작은 규모로서는 보통의 분자생물학자들도 기능에 관한 정보가 없는 새로운 서열들과 대면하고 있다. 새로 확인된 유전자가 전사조절인자, 세포골격 단백질, 또는 대사과정의 효소에 대한 정보를 담고있는지에 관한 어떤 힌트라도 실험적인 결과를 해석하는데 도움을 줄 것이며 계속되는 연구에 방향을 제시할 수 있을 것이다.

Protein versus domain classification

이 질문에 답하는데 첫 번째 단계는 BLAST나 유사한 프로그램을 사용한 데이터베이스 검색이다. 잘되면 BLAST 결과는 query 단백질의 전체 길이에 걸쳐 잘 연구된 단백질과 유사성을 보여줄 것이다. 최악의 경우는 아무런 연관도 보여주지 않을 것이다. 실제로 가장 빈번한 결과는 부분적으로만 단백질들(대부분 그 특성이 밝혀지지 않은)에 일치를 보이고 나머지 부분은 의심스러운 상태로 나오는 것이다.

이러한 혼란의 대부분은 관련된 단백질들의 modular architecture에 기인한다. 알려진 3-D 단백질 구조들의 분석은 대부분 다수의 folding unit들을 포함하고 있음을 보여준다. 각 단위는 domain이라 불리며 그 자신의 소수성 중심을 가지고, 내부적으로 잔기와 잔기 간의 접촉들을 만족시키고 있다. 이러한 조건들을 충족시키기 위해서는 독립적인 도메인들은 금속이온이나 이황화가교를 가지지 않는 한 최소한 50개 정도의 잔기들을 가져야만 한다. 단백질 서열들의 분석은 이러한 구조적 개념을 만족시켜준다; 서열 쌍들은 자주 국부인 유사성을 보여주고, 나머지는 완전히 다른 것을 보여준다. 이러한 소위 상동성 도메인 (homology domain) 들에서 folding의 독립성은 실험적으로 증명되지는 않았다. 그러나 그들의 실제로 전후관계로 독립성 (context independence)을 보여준다; 즉, 이들은 여러 가지 도메인 배치에서 나타나며 다른 단백질에서는 중단되지 않은 서열에 삽입된 상태로 발견된다.

단백질 분류를 논의할 때면 상동성 도메인들도 자주 독립적인 기능들을 가지고 있다는 것을 주목해야한다. 어떤 도메인들은 효소활성을 가지고, 어떤 것은 작은 전령분자들과 결합하며, 다른 것들은 DNA, RNA, 또는 단백질과 결합한다. Multidomain 단백질의 경우는 따라서 하나 이상의 기능을 가지며 하나 이상의 단백질 집단이나 부류에 속한다. 이런 이유로 단백질을 기능적으로 분류하는 현재의 접근은 전체 단백질이 아니라 도메인에 집중되어 있다.

Tools for superfamily assignment

여러 연구집단들은 단백질 서열들을 집단 (families)과 초집단 (superfamilies)로 구분하기 위해 노력해왔다. 여러 가지 접근들은 그 자동화의 정도, 포괄성, 완전한 단백질이나 도메인에의 초점과 사용된 방법에서 다르다. 이러한 노력들의 일부는 현존하는 서열자료들을 분류하는데 집중되고 있다. 다른 것들은 한 단계 더 나아가 서열 집단들로부터 필수적인 특성들을 추출하고 이것들을 도메인이나 motif descriptor들의 형태로 저장하고 있다. Descriptor들은 사용자가 제공한 단백질 서열들을 가지고 검색하는데 사용할 수 있다. 이러한 검색들의 높은 정밀도는 미확인 단백질들의 기능적인 지정에 가장 유용한 것으로 증명되었다. 동시적인 개발로는 단백질 3-D 구조들의 분류이다.

가장 널리 쓰이는 집합들 중 어떤 것은 단백질들의 modular 성질을 존중하는 것으로 곧 논의될 것이다. 해당하는 WWW 주소는 URL Box에 기술되어 있으며, 대부분의 관련된 데이터베이스와 검색도구도 ftp로 받을 수 있다 (표 1).

PROSITE pattern library는 기능적으로 중요한 단백질 모티브들에 대한 descriptor들을 수집하는데 있어 선두역할을 한 것들 중 하나이다. 이것은 한 단백질 집단에서 가장 잘 보존된 잔기들에만 중점을 두는 regular expression syntax에 근거하고 있다. 하나의 PROSITE 유형 (pattern)은 하나의 완전한 도메인 또는 단백질을 묘사하는 것이 아니라 효소의 촉매자리와 같은 기능적으로 가장 중요한 잔기들의 조합들을 확인하고자 노력하고 있다. PROSITE expression K-x(1,2)-[DE]는 하나의 lysine 잔기가 하나 또는 두 개의 무작위적인 잔기들 (x), 그리고 D 또는 E가 뒤따른다는 것을 표시한다. 유형은 주어진 서열에 존재하거나 존재하지 않는 것으로 발견될 수 있다; 중간 score는 없다. 현재 PROSITE pattern library는 1292개의 entry를 포함하고 있으며 따라서 가장 포괄적인 집합이다. 추가적인 보너스로 모든 모티브들은 관련된 문헌의 기록이 연결되어 있다. 그러나 PROSITE의 syntax는 매우 방산된 단백질 집단들을 나타내기에는 너무 융통성이 없다. 그 외에도 많은 짧은 유형들은 오늘날의 큰 단백질 데이터베이스에서 통계적으로 의미있는 match들을 이끌어내기에 충분한 정보를 가지지 못하고 있다. 따라서 데이터베이스 검색을 수행할 때 false positive hit들이 나올 것으로 예상되며 따라서 매우 조심하여야만 한다.

이러한 문제들을 극복하기 위해서는 PROSITE pattern library는 1995년 이래 PROSITE profile library로 증진되어왔다. 일반화된 profile들은 sequence-to-sequence 비교와 한 서열에 대한 regular expression의 matching 사이에 중간적인 위치에 있다. 한 단백질 집단 내의 잘 보존된 위치들은 alignment score의 계산에서 높은 점수를 받는 반면 덜 보존된 위치들은 완전히 무시되는 대신에 낮은 점수를 받는다. PROSITE profile들은 가능한 완전한 도메인들을 포함하려고 노력하고 있다. 그 체재는 비록 검색에 사용되는 프로그램들이 다르기는 하지만 generalized PROSITE 체재에 적용되어 있다. 각 sequence-to-profile match는 score를 받고, 이것은 통계적으로 신뢰성있는 값으로 전환된다. 두가지 다른 cutoff value들은 매우 의미있는 또는 경계상의 match들 각각에 대하여 특이적이다. PROSITE library에서 profile들은 pattern들이 실패하는 경우에 주로 사용된다. 현재 PROSITE에는 단지 56개의 profile들이 존재하며 추가적으로 300개가 prerelease 상태에 있다; 이들은 검색되거나 다운로드될 수 있으나 적절한 설명은 연결되어 있지 않다.

ProDom 데이터베이스는 완전한 단백질 도메인들에 대한 최초의 포괄적인 집합이었다. 이것은 SWISS-PROT로부터 완전히 자동적인 방법으로 구성되었다. 그 결과 도메인들은 cluster number들로만 표시되어 있고, 어떤 생물학적 기능도 설명되어있지 않다. 더군다나 자동적으로 결정된 도메인 영역들은 신뢰할 수 없으며 연관된 검색 방법들도 별로 정밀하지 못하다.

Pfam은 ProDom에서 진화한 것으로 개념적으로 PROSITE profile들과 연관된 HMM들의 집합이다. Pfam 모델들은 전형적으로 완전한 단백질 도메인들에 걸쳐 있으며 HMMER package나 Web-based server로 검색될 수 있다. 현재의 버전은 Pfam(2.1)로 527개의 모델들을 포함하고 있다; 곧 나올 다음 버전 (3.0)에서는 그 숫자가 806개로 증가할 것이다. PROSITE profile과 유사하게 Pfam 모델들은 분명한 homolog들로부터 출발하여 점차적으로 먼 집단들의 구성원들을 포함시키면서 반복적으로 정련된다.  r들의 information-rich descriptor들 때문에 두가지 집합들은 다른 방법으로는 드물게 발견되는 단백질 모티브의 매우 먼 예도 검출한다. PROSITE와는 대조적으로 Pfam entry들은 semi-automatic하게 생성되고, 이것은 비교적 낮은 정밀도를 보여주지만 개정과정은 보다 쉽다. Pfam documentation은 최소한이지만 자주 상응하는 PROSITE entry에 대한 연결이 포함되어 있다. Pfam 모델들과 PROSITE profile들은 상호전환이 이루어질 수 있고, 조합 검색이 가능하다. SMART 데이터베이스는 신호전달에 포함된 단백질 도메인들에 초점을 맞춘 181개의 HMM들의 독립적인 집합이다.

BLOCKS와 PRINTS는 여러 가지 짧은 ungapped multiple alignment 절편들에 의한 단백질 또는 도메인 집단들을 나타내는 모티브 데이터베이스이다. BLOCKS의 현재 판 (10.1)은 972개의 집단들을 포함하고 있으며, 이들은 PROSITE pattern들로부터 유래하였다. PRINTS (19.0)는 현재 925개의 집단들을 포함하고 있으며, 이들 중 일부는 PROSITE entry들로부터 다른 것들은 독립적으로 유도된 것이다. PRINTS 모티브들 역시 반복적으로 정련되어 BLOCKS에 비해 증가된 정밀도를 보인다. PRINTS의 특별한 강점은 PROSITE에 비견할 수 있는 entry들의 풍부한 설명이다. 그 유사한 구조 때문에 BLOCKS와 PRINTS는 동일한 프로그램으로 검색될 수 있으며 어떤 Web server는 두가지에 대한 검색을 동시에 제공한다.

What next?

위에서 설명한 superfamily 분류에 대한 비교를 읽고나면 □BLAST 대신에 domain 데이터베이스를 검색해야만 하는지□ 또는 □어떤 데이터베이스를 사용해야할 지□ 물어올 것이다. 그 대답은 간단하다. 가능한 BLAST를 포함하여 모든 것을 사용해야 한다는 것이다. 도메인 데이터베이스들은 상당히 중첩되지만 그들은 모두 특별한 장점을 가지고 있다. 따라서 신호전달에서 중요한 도메인들은 PROSITE profile들이나 SMART에서 발견될 가능성이 높고; Pfam은 세포외 도메인들, PROSITE pattern들은 활성자리 모티브에 의해 분류된 효소 집단들을 확인하는데 좋다. 도메인 데이터베이스들이 중첩되는 경우라도, 분명한 반복은 분류의 신뢰도를 높여준다. 동일한 query 단백질을 사용하였을 때 세가지 다른 분류 server들의 출력이 그림 1에 보여져 있다.

그림 1. Example output from three Web-based domain identification servers, using the same protein (human Vav oncogene. SWISS-PROT VAV_HUMAN) as the query. (a) The output of the PROSITE profile server at the SWISS Institute for Experimental Cancer Research (ISREC). Hit list에서 도메인 이름들은 추가적인 정보에 연결되어 있다. (b) The output of the SMART server at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL). 색깔이 칠해진 상자들은 도메인 정보와 연결되어 있다. (c) The graphical output of the Pfam server at Washington University. 원래의 검색에서 나오는 추가적인 정보를 제공하는 textual output은 삭제되어 있다.

질적인 평가기준으로서 이용가능한 도메인 descriptor들의 수는 과소평가 되어서는 안된다. 왜냐하면 데이터베이스들과 연관된 검색방법들은 일반성과 정밀도에 있어서 다르기 때문이다. 예를 들어 PROSITE profile들의 비교적 적은 prerelease library는 70개의 매우 의미있는 도메인 match들을 어떤 것과도 유사성이 없는 것으로 분류된 효모의 880개 유전자 중에서 발견하였다. Pfam 3.0은 36개의 match들을 보고하였고, 반면 PROSITE pattern collection은 114개를 찾았으나 그 대부분은 아마도 false positive이었다.

여기서 충분히 논의될 수는 없지만 추가적인 문제는 superfamily 분류를 정련하는 것이다. 대부분의 모티브 데이터베이스는 가능한 일반적이 되려고 노력하고 있다. 예를 들어 glucose transporter에 대한 entry를 발견하려고 하기보다는 sugar transporter 모티브나 또는 가능하다면 보다 일반적인 transporter 집단에 대한 것을 기대할 것이다. 이러한 보고가 나온 후에 어떤 종류의 transporter에 속하는지 예측할 수 있는 분류 system이 바람직할 것이다. 불행하게도 아직 그런 system은 없다. 단백질의 정확한 기능을 예측하는 가장 가능성 있는 접근은 다른 종에서 밝혀진 ortholog를 찾는 것이다. 우리가 불완전하게 분석된 게놈들을 가지고 일해야하는 한 real ortholog는 알려지지 않은 채 가장 좋은 database hit는 연관된 그러나 다른 기능을 가지는 잘 보존된 paralog일 것이다. 만약 database에서의 가장 좋은 match가 □glucose transporter, brain isoform'이라면 그 서열이 다른 transporter에 비해 분명히 glucose transporter와 가까운지를 살펴보아야할 것이다. 너무 자세한 예측을 하는 것은 바람직하지 않다: query가 glucose transporter의 brain isoform이라고 결론짓는 것은 너무 과장된 것이다. 완전히 자동화된 예견 system은 이러한 잘못에 취약하고, database에는 잘못 위임된 서열들이 많이 포함되어 있다.

Domain database 검색들, BLAST 검색들 그리고 subfamily classification의 조합을 사용하는 것이 하나의 서열을 분석하는데 너무 많은 노력을 기울이는 것처럼 보일지도 모른다. 그러나 단백질의 기능을 확인하기 위하여 실험으로 몇 달의 시간을 보내는 것보다는 컴퓨터에서 몇 시간을 보내는 것이 가치있는 일일지 모른다.