Fundamentals of database searching (자료검색의 기초)

(by Stephen F. Altschul)

새로운 서열들을 이미 특성이 밝혀진 유전자나 단백질들과 배열하는 것은 그들의 공통적인 속성이나 진화적인 기원에 관한 중요한 통찰을 제공한다. 이 장에서는 서열배열들을 평가하는데 사용되는 전산 도구들의 기본원리에 대하여 논의하고자 한다.

효과적인 DNA 서열분석 방법으로 단백질의 구조나 기능보다도 그 아미노산 서열에 대한 정보를 얻기가 훨씬 수월해졌다. 상동 단백질들은 그 구조나 기능은 변화가 거의 없더라도 그 서열들은 시간이 지남에 따라 크게 달라진다. 따라서 특성이 밝혀지지 않은 단백질이 잘 연구된 단백질과 높은 서열상 유사성을 가진다면 많은 정보가 얻어질 수 있다. 이것이 바로 DNA와 단백질 서열들을 비교배열하는 이유이다. 다른 목적으로는 계통수를 재구성하고 유전자나 조절 영역들을 파악하는 것이다.

Global and local sequence alignment

배열은 연관된 서열들을 비교하는 강력한 방법이나, 다른 한편으로는 차이점을 찾아내는 데도 사용될 수 있다. 두 개의 잔기의 배열은 공통적인 진화적 기원을 나타내거나, 진화적 역사와 항상 일치하는 것은 아니지만 공통적인 구조적 기능을 보여줄 수도 있다.

배열들은 일반적으로 가장 공통적인 돌연변이들 (삽입, 결실, 단일 잔기의 치환)을 묘사하는데 제한되어 있다. 삽입이나 결실은 null characters로 표시된다. 치환은 두 개의 다른 글자로 표시된다.  서열들은 비교의 목적에 따라 global 또는 local alignment로 비교될 수 있다 (그림 1 참조). Global alignment는 입력된 서열들이 완전한 배열을 이루도록 하고, local alignment는 그들의 가장 유사한 절편만을 배열한다. 사용된 방법들은 서열들이 그들의 전체 길이에 걸쳐 연관되어 있는지 또는 단지 국한된 영역에서만 일치하는 지로 추정된다. 비록 global 과 local alignment의 알고리즘들은 유사하지만 그 결과를 평가하는데 필요한 통계학은 아주 다르다.

그림 1. Two protein alignments.

(a) 사람 cytochrome c (105개의 잔기, SWISS-PROT accession number P00001)와 Rhodopseudomonas palustric cytochrome c2 (114 residues. accession number P00090)의 optimal global alignment. (b) 사람 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (1480 residues, accession No. P13569)와 E. coli nickel transport ATP-binding protein NIKD (253 residues, accession No. P33593)의 optimal local alignment. 두가지 배열에 대한 score들은 BLOSUM62 아미노산 치환행렬과 길이 k의 gap을 가지는 것에 -(11+k)의 score를 정하는 affine gap cost들을 사용하여 계산되었다. 두가지 입력된 서열들을 배열에 완전히 포함시키기 위해서는 score 131을 가지는 global alignment가 요구되며 Needleman-Wunsch algorithm을 사용하여 구성되었다. Score 89를 가지는 local alignment는 score를 용납하는 입력 서열의 부분들만이 포함되며, Smith-Waterman algorithm을 사용하여 구성되었다. 중간에 있는 선에는 동일한 아미노산들과 유사한 아미노산을 가리키는 + 가 표시되어 있다 (즉, 양의 score를 받는 배열을 가지는 아미노산들).

Alignment score

많은 수의 가능한 배열들로부터 선택하기 위한 정규과정은 이들에게 score들을 부여하는 것이다; 가장 자주 사용되는 규약은 score가 높을수록 배열이 더 좋다. 배열 score에는 많은 가능한 정의들이 있다. 그러나 가장 공통적인 것은 단순히 배열을 이루는 것에서 배열된 글자들의 쌍들에 주어진 score들을 합이다. 치환 score (substitution score)는 배열될 수 있는 글자들의 각 쌍에 대해 골라진다; 이러한 score들의 완전한 set 이 치환 matrix 이다 [PAM and BLOSUM 들은 단백질 서열비교에 가장 보편적인 것이다]. 추가적으로 gap들에 대한 score들이 선택된다. 이것들은 다른 것의 글자와 배열된 한 서열 내에 있는 하나 또는 그 이상 이웃하는 null들로 구성된다. 한번의 돌연변이는 하나 이상의 잔기를 삽입시키거나 결실시킬 수 있기 때문에 긴 gap은 짧은 gap 보다 벌점이 약간만 가해져야할 것이다. 따라서 하나의 gap의 존재에 대해 비교적 높은 벌점을 부과하는 affine gap cost들과 그 gap이 가지는 각 잔기들에 대한 보다 작은 벌점이 gap scoring 시스템에서 가장 널리 사용되고 있다.

서열 비교의 실질적인 효율은 적절한 치환과 gap score들의 선택에 달려있다. Ungapped local alignment들에 대해서는 어느 치환 score들이 우연한 유사성으로부터 진짜 생물학적 연관을 보여주는 배열들을 가장 잘 구분하는지를 설명해주는 완전한 이론이 존재한다. 그리고 이러한 배열은 관련된 서열들 사이의 진화적인 분기의 정도에 의존하므로 이에 맞추어진 일련의 matrix들이 필요하다. 이것이 바로 PAM과 BLOSUM 계열의 아미노산 치환 matrix들을 구성하는데 바탕을 이루는 인식이다. 이러한 matrix들은 일반적으로 gapped local과 global alignment에 수정되지 않은 상태로 사용된다. gap cost들을 선택하는데 대해 널리 적용되는 이론은 없으며, 그 선택은 trial and error에 의해 이루어진다.

Alignment algorithms and database searches

무작위적인 배열의 score를 정의하고 나면 두 서열의 최적의 (i.e. highest scoring) 배열(들)을 찾아야만 한다. 다행스럽게도 위에서 논의된 additive score들이 주어지면 비교적 효율적인 dynamic programming algorithm들의 set을 이 일에 이용할 수 있다. 생물학적 문헌에 처음으로 기술된 것은 전체적인 배열을 위한 Needleman-Wunsch algorithm이다. 이어서 약간 변형된 것이 나타났는데 이것이 Smith-Waterman algorithm으로서 두 개의 서열의 최적의 국부적인 배열을 찾을 수 있는 것이다. 이 두가지 algorithm들은 비교되는 서열들의 길이의 곱에 비례하는 시간이 필요하다. 원래는 어느 것도 affine gap cost들을 다룰 수 없었으나 현재는 이 일을 할 수 있도록 수정되었다.

DNA와 단백질 서열들 간의 유사성은 자주 국부적인 영역들에만 걸쳐있기 때문에 가장 보편적인 자료유사성검색 프로그램들은 Smith-Waterman local alignment 알고리즘에 기초를 두고 있다. 그러나 이것을 사용할 경우는 특별한 목적을 가진 하드웨어나 많은 수의 병렬로 연결된 컴퓨터가 없이는 시간이 너무 느리다. 따라서 FASTA (http://www2.ebi.ac.uk/fasta3/)와 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 프로그램은 가장 잘 맞을 것 같은 서열부분에만 집중하는 heuristic (스스로 발견케하는) 전략들을 사용한다. 신속한 exact-match 과정은 우선 가능성 있는 영역들을 확인하고, 그 다음에 Smith-Waterman을 실시한다. 이러한 접근은 FASTA와 BLAST로 하여금 우연한 유사성을 간과케 함으로써 완전한 S-W 보다 10-100 배나 빠른 운행을 가능케 한다.

FASTA와 BLAST의 몇가지 조절 가능한 변수들은 그들의 heuristics를 조절케 함으로써 속도와 정밀도 사이의 교환에 영향을 미친다. 어떤 배열 프로그램이던지 그 유효성은 그것이 채용하는 scoring system에 의존한다. 가장 중요하게는 진짜 상동성에 해당하는 단백질 유사성들은 거의 언제나 DNA 유사성보다는 우연에 의한 것으로부터 구별하기가 쉽다. 따라서 검색을 수행하기 전에 항상  DNA는 번역되어져야만 한다.

The statistics of alignment scores

두 개의 서열의 global 또는 local alignment의 생물학적 적절성을 시험하기 위해서는 우연에 의해 기대되는 alignment score가 얼마나 큰지 알 필요가 있다. 여기서 '우연 (chance)'는 다음과 같은 것들의 비교를 의미할 수 있다: (1) 진짜이면서도 연관이 없는 서열들; (2) 구성상의 특성들을 보존하기 위해 섞여진 진짜 서열들; 또는 (3) DNA 또는 단백질 서열모델에 근거한 무작위적으로 생성된 서열들.

Global alignment score들의 무작위적 분포에 대한 실제적인 값에 관해서는 알려진 바가 거의 없다. 그러한 값들의 중요성을 평가할 수 있는 몇 안되는 것 중의 하나는 동일한 길이의 많은 무작위적 서열들의 배열에서 나타나는 경험적인 score distribution을 만드는 것이다. 이 점수분포로부터 alignment score의 Z 값 (평균값에서 벗어나는 표준편차들의 수)이 측정될 수 있다. 그렇지만 정확한 중요성의 평가는 현재로서는 Z 값으로부터 유도될 수 없다.

다행스럽게도 local alignment score들의 통계학에 대해서는 많이 알려져 있다. 타당한 추정에 의하면 적절한 ungapped local alignment들의 random score distribution은 extreme value distribution을 따르는 것으로 증명될 수 있다. 그러한 증거는 gapped local alignment에 대해서는 불가능하나, 전산 실험에 의하면 동일한 유형의 distribution이 적용될 수 있다고 한다.

FASTA와 BLAST 검색 프로그램들은 현재 extreme value distribution에 근거하여  그들이 회신하는 배열들의 통계학적 중요성의 평가뿐만이 아니라 raw score들을 보고한다. 가장 간단하게는 이러한 평가들은 E value들의 형태를 가진다. 주어진 배열에서 E value는 검색서열과 검색된 자료의 길이 만이 아니라 그 score에도 의존한다. 이것은 순전히 우연에 의해 발생했을 수 있을 것으로 기대될 수 있는 것과 동등한 또는 그보다 우월한 score를 가진 분명한 배열들의 수를 나타낸다. 따라서 5의 E value 값은 통계적으로 무의미하나 0.01은 그렇지 않다. BLAST는 또한 bit score를 보고해준다. 이것은 raw score들의 비례값이다. Bit score는 채용된 scoring system의 통계적인 변수들을 고려에 넣는다. 그래서 배열의 질을 나타내는데 있어 raw score보다 많은 정보를 준다.

Making regions of restricted composition

많은 DNA와 단백질 서열들은 여러 번 반목되는 짧은 요소들의 매우 제한된 핵산과 아미노산 구성과 영역들의 영역들을 포함하고 있다. 표준 alignment model들과 scoring system들은 이러한 low-complexity region들로 이끄는 진화적인 과정을 잡아내도록 고안되지는 않았다. 그 결과 구성상 편향된 영역들을 가지는 두 개의 서열들은 이러한 편향만을 반영하는 매우 높은 유사성 score를 받을 수 있다. 많은 경우 이러한 영역들은 별로 중요하지 않으며 다른 중요한 유사성을 가릴 수 있다. 따라서 입력이나 자료 서열들로부터의 low-complexity를 거르는 프로그램들은 불필요한 자료검색들을 유용한 것으로 바꿀 수 있다.

Multiple sequences

Global과 local pairwise 서열비교와 배열은 다수의 서열로 일반화될 수 있다. Multiple alignment들로부터 profile들 [hidden Markov model들 (HMMs)에 연관된]이 추출되고 이들은 자료검색 방법들의 정밀도를 진화적으로 멀거나 미묘한 서열관계들로 증진시킬 수 있다.