산화적 인산화
마. Chemiosmotic hypothesis (1961, Peter Mitchell)
NADH의 산화는 어떻게 ADP의 인산화와 연결되어 있는가 ?
전자운반에서 유래된 고에너지 중간체가 존재한다고 믿어져왔으나, 그 실체는 발견되지 않았다. Peter Mitchell은 그 대신 전혀 새로운 가설을 제시하였다. 그는 내부막에서의 전자전달은 양성자기울기를 낳으며, 이것이 pH 기울기와 전기적 기울기를 만든다고 하였다. 이것이 기질로 되돌아오려는 경향 (proton motive force)가 ATP 합성과 짝지워져있다고 주장하였다. 결과적으로 proton motive force는 ATP 합성효소에서의 구조적 변화와 연결된다.
proton motive force: 양성자 농도와 전위차
증거: 1. 전자전달에 의해 proton gradient가 생기는가 ?
2. 전자전달 없이도 pH gradient가 주어지면 ATP 합성이 일어나는가 ?
3. Bacteriorhodopsin과 beef-heart mitochondria의 ATP로 재구성된 synthetic vesicles에서 ATP 합성이 일어나는가 ? (Racker와 Stoeckenius의 재구성실험)
4. ATP synthase는 막에 비대칭적으로 위치한다.
5. Closed compartment is essential for oxidative phosphorylation.
6. proton carrier들은 proton gradient를 분산시켜 산화와 인산화의 연결을 방해한다.
1. Proton-motive force의 생성은 3군데에서 일어난다
첫 번째, 이것은 여러가지 기질의 산화에서 나오는 ATP yield 비교하여 확인되었다.
P/O ratio: 산화적 인산화의 지표로서 사용되는데, 소모되는 산소원자당 유기인산으로 전환되는 무기인산의 분자수를 말한다. 이는 전자쌍이 환원된 조효소로 부터 산소로 전자전달계를 따라 흘러가면서 생성되는 ATP의 분자수와 동일한 개념이다. NADH의 P/O ratio는 3이며, succinate는 2, ascorbate는 1이다.
두 번째, 열역학적 측정에 의해 확인되었다. 전자전달에 대한 △Go' 는
NADH to the lowest Fe-S in NADH-Q reductase -12 kcal/mol
cyt.b to cyt.c1 in cyt. reductase -10
cyt.1 to O2 in cyt. oxidase -24
세 번째, 전자전달의 저해제를 사용하여 확인되었다.
네 번째, 재구성된 vesicle에서 proton-motive force의 생성으로 확인되었다.
2. open question
전자전달에 따른 양성자의 운반: NADH로부터 두 개의 전자가 산소로 전달되는 과정에서 전달되는 양성자의 수는 10개로 추정되고 있다 (복합체 I에서 4개, 복합체 III에서 4개, 그리고 복합체 IV에서 2개). 그렇지만 그 값은 정수가 아닐지도 모른다.
양성자의 전달은 어디에서 일어나는가? 전자전달과 동일한 자리에서 일어나는가? 아니면 다른 자리에서 일어나는가? 전자의 경우는 하나의 전자마다 단지 하나의 양성자 만이 전달 가능하다. 그러나 실제로 측정되기는 한 장소당 3-4 씩의 양성자가 전달되므로 후자의 경우에 해당하는 간접적인 구조적 상호작용에 의한 작용일 가능성이 높다. 즉, 복합체 내에서 전자전달과 양성자전달에 관여하는 자리는 다르며, 이들 간에 구조적 상호작용이 일어날 것으로 추정된다.
바. ATP synthase: ATP 생성효소 또는 F1Fo-ATPase라고 불린다.
1. 구조: Fo과 F1 복합체
전자현미경 사진에 의하면 돌기들이 기질과 면하는 쪽의 내막에 존재하며, 흔들어주면 제거되는 것을 발견하였다. 이 부분 (F1)은 ATP 가수분해효소의 촉매활성을 가지고 있다. 이것이 제거된 막은 전자운반은 수행하지만 ATP는 생성하지 못한다. 그리고 재구성 실험을 실시하면 원상으로 회복된다.
F1 복합체는 αβγδε의 다섯가지 단위체로 구성되며, αβ는 3개씩 돌기부분을 형성하고, γδε는 줄기부분을 형성한다. δε는 F1과 Fo의 상호작용을 조절하고, γ는 양성자출입을 조절하는 문으로 작용한다.
Fo 복합체는 a b c의 3가지 단위체로 구성되며 (ab2c10-12), 막에 파묻혀 있고 c는 통로를 형성하는 역할을 맡고있다.
2. ATP 생성 기작: ATP synthase에서 양성자 흐름에 의한 ATP 생성은 어떻게 일어나는가 ?
Paul Boyer는 전자전달단백질로부터 ATP 합성에 관여하는 효소로의 에너지 전달로 가역적인 구조적 변화가 일어나며 이것이 ATP 합성과 연결되어 있다고 제안하였었다. 이것이 궁극적으로는 Binding change mechanism으로 귀착된다.
ATP synthase는 다른 ATP 가수분해효소와 다른 반응기작을 가진다. ATP synthase는 SN2 치환반응을 통해 ATP를 생성한다. Isotope-exchange 실험에 의해 Enzyme-bound ATP form은 양성자기울기가 없이도 쉽게 형성된다는 사실이 알려졌다. 즉, 효소에 결합된 ATP의 생성은 에너지를 필요로 하지 않고, 다만 ATP의 방출에 필요하다. 다시 말하면, 양성자흐름에 의한 에너지는 구조적 변화를 야기시켜 ATP의 방출에 관여한다.
사. ADP와 ATP의 이동
이들은 미토콘드리아 내막을 자유롭게 통과하는 것이 아니라 ATP-ADP translocase라는 운반단백질을 통해 이동한다. 이 두개의 전달은 연결되어 있어서 ATP가 존재해야만 ADP가 들어갈 수 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이 단백질은 내막 단백질의 약 14%를 차지하고 있다.
양성자 3개가 전달될 때마다 ATP 한 분자가 생긴다. 그런데 ATP가 밖으로 나가고 ADP가 들어오면 양성자 하나를 손해보는 셈이므로, 결과적으로 ATP 한 분자의 생성에 4개의 양성자가 전달되는 결과가 된다. 따라서 전자전달에서 비롯되는 에너지의 약 1/4은 ATP 전달에 소비된다. 그러나 박테리아 경우는 이 교환이 필요 없다. |
ATP-ADP translocase는 30-kDa의 subunit로 구성된 dimer로서 하나의 결합자리가 존재하며, ATP와 ADP 각각에 대하여 동일한 친화력을 가지고 있다. 그런데 positive membrane potential에서는 기질로부터 세포질로의 반전은 ATP에 대해서 훨씬 빨리 진행한다(약 30배). 그 이유는 전하의 차이에 있다. 즉, 기질은 상대적으로 음전하의 상태이므로 음전하가 높은 ATP가 이동되는 것이 선호된다. 그런데 ATP와 ADP의 교환이 일어나면서 막전위는 감소하게 되므로 전자전달에서 나오는 에너지의 1/4 정도는 이것에 의한 막전위의 감소를 보충하는데 사용된다.
아. ATP yield (from the complete oxidation of glucose)
해당과정에서 생기는 NADH의 미토콘드리아로의 전달 (간접전달 방식)
1. glycerol phosphate shuttle
cytoplasmic glycerol dehydrogenase
mitochondrial glycerol dehydrogenase(FAD prosthetic group)
net reaction:
NADH(cyt)+ H+ + E-FAD(mit) --> NAD+(cyt) + E-FADH2(mit)
2. Malate-asparate shuttle
2개의 막운반체와 4개의 효소들이 관여
transamination과 deamination 반응은 α-ketoglutarate와 glutamate의 전환에 의해 이루어진다.
net reaction: NADH(cyt) + NAD+(mit) --> NAD+(cyt) + NADH(mit)
두가지 shuttle의 차이점은 (1)은 1 ATP를 손해보면서 NADH 농도경사에 구애받지 않고 NADH가 mitochondria로 전달되어 FAD로 전자를 전달하나, (2)는 세포질 내의 NADH/NAD+ 농도가 높을 떄에만 전달된다는 것이다. 따라서 shuttle 1을 사용할 경우는 NADH로부터 2분자에 해당하는 ATP 생성 (따라서 모두 4개가 추가), shuttle 2를 사용할 경우는 3분자에 해당하는 ATP 생성 (따라서 모두 6개가 추가)된다.
Glucose가 산화될 때의 총결산을 해보면. 앞서 기술한 ATP 하나의 합성에 4개의 양성자 전달이 일어난다는 사실 (3개의 양성자는 ATP synthase로부터 ATP 방출, 1개는 ADP의 유입)을 적용한다면 NADH의 전자전달에서 방출되는 10개의 양성자 당 10/4 = 2.5개의 ATP, FADH2의 전자전달에서 방출되는 6개의 양성자 당 6/4 = 1.5개의 ATP 생성으로 계산될 수 있다. 따라서 기존의 방식대로 3 또는 2로 적용하였을 경우와 비교하였다. 그렇지만 세균의 경우는 최대 38 ATP까지 가능하다 (왜?)
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해당과정 |
TCA 회로 |
glycerol phosphate shuttle |
malate-asparate shuttle |
||
ATP |
2 |
2 |
4 |
4 |
||
NADH |
2 |
8 |
8 x 3 = 24 2 x 2 = 4 |
8 x 2.5 = 20 2 x 1.5 = 3 |
10 x 3 = 30 |
10 x 2.5 = 25 |
FADH2 |
|
2 |
2 x 2 = 4 |
2 x 1.5 =3 |
2 x 2 = 4 |
2 x 1.5 = 3 |
net |
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36 |
30 |
38 |
32 |
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곤충의 근육 |
심장과 간 |
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자. 인산화의 조절
산화적 인산화는 ATP의 필요에 따라 좌우된다. ADP가 ATP로 인산화되지 않는 한 전자들은 전자전달계로 들어가지 않는다.
산화적 인산화에 필요한 것들은 NADH, O2, ADP, Pi 인데, 그중에서도 ADP가 가장 중요하다. 따라서 ADP를 주어야만 산소 소모가 진행된다. 그런데 ADP의 농도증가는 ATP 소모로 부터 비롯되므로 ATP가 사용되지 않는 한 산화적 인산화는 진행되지 않는다.
차. Uncouplers (짝풀음제)
전자전달과 인산화의 연결을 방해하는 분자들로 2,4-dinitrophenol (DNP)와 산성 방향족 화합물들이 있다. 이들은 미토콘드리아 내막의 양성자 운반체들로서 작용하여 양성자 기울기를 망가뜨린다. 그런데 이러한 짝풀음제를 생물학적으로 이용하는 것이 있다. 갈색지방조직의 미토콘드리아 내막에 있는 thermogenin (33-kDa의 dimer)은 이러한 기능에 사용된다. 이것은 겨울잠을 자는 동물들에서 체온을 유지하는데 필요한 열을 발생하는 방법으로 사용된다. 갈색지방 조직은 겨울잠을 자는 동물에서 열발생을 위해 분화된 조직인 것이다.