citric acid cycle (tricarboxylic acid cycle, Krebs cycle)

 

Amphibolic pathway (cellular metabolism의 중심축 역할): 산소 존재하에서 ATP 생성을 위한 주분해 경로인 동시에 생합성을 위한 전구체들을 제공한다. (산화과정에서 NAD+와 FAD의 보충은 산소로의 전자전달에 의해서만 일어난다).

pyruvate는 미토콘드리아로 전달되어 (pyruvate-H+ symport) acetyl CoA와 이산화탄소로 산화된 후 TCA 회로로 들어간다.

(pyruvate이외에도 지방산과 아미노산들이 분해되어 acetyl CoA를 제공)

 

가. 경로 (a series of 9 reactions)

        pyruvate + CoA + NAD+ → acetyl CoA + CO2 + NADH + H+

        oxaloacetate + acetyl CoA + H2O → citrate + CoA + H+

        citrate ↔ cis-aconitate + H2O isocitrate

        isocitrate + NAD+ + CoA → α-ketoglutarate + NADH + H+ + CO2

        α-ketoglutarate + NAD+ + CoA → succinyl CoA + CO2 + NADH + H+

        succinyl CoA + Pi + GDP → succinate + GTP + CoA

        succinate + FAD ↔ fumarate + FADH2

        fumarate + H2O ↔ malate

        malate + NAD+ ↔ oxaloacetate + NADH + H+

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 pyruvate + 4NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O → 3CO2 + 4NADH + FADH2 + GTP + 4 H+

 

나. enzymes

1. pyruvate dehydrogenase complex: 세가지 종류의 효소들이 비공유결합으로 뭉쳐진 복합체를 형성하고 있다 (multienzyme complex). 대장균의 경우 모두 60개 사슬로 구성되며 4600 kd의 분자량을 가진다 (more complex in eukaryotic enzymes).

        pyruvate dehydrogenase (PDH), 24 subunits: TPP, oxidative decarboxylation 반응

        dihydrolipoyl transacetylase (DLT), 24 subunits: lipoic acid와 CoA, acetyl 기를 CoA에 전달 

        dihydrolipoyl dehydrogenase (DLD), 12 subunits: FAD와 NAD, 산화형의 lipoamide를 재생

TPP, lipoic acid, FAD는 보결원자단으로 관여한다.

효소촉매반응: PDH의 TPP는 carbanion을 형성하여 pyruvate와 결합한 후 탈카르복시화 반응이 일어나면서 hydroxyethyl-TPP를 형성한다. 이 hydroxyethyl-TPP의 hydroxyethyl 기는 산화되어 acetyl 기를 형성하면서 DLT의 lipoamide에 전달된다. Lipoamide에 결합된 acetyl 기는 CoA로 전달되면서 acetyl CoA가 형성된다. 환원된 dihydrolipoamide는 DLD의 FAD에 수소원자를 전달하고 이들은 다시 NAD+로 이동한다.

 

2. citrate synthase: 포유동물의 경우 49 kd 분자량의 두 개의 동일한 단위체로 구성되어 있다. 이 효소는 acetyl CoA와 oxaloacetate 두 개의 기질을 가지고 있다. 우선 oxaloacetate가 결합하면서 구조상의 변화가 일어나야만 acetyl CoA와 결합을 이룰 수 있다. 왜냐하면 두 개의 기질이 결합하여 가수분해에 의해 CoA가 떼어지는 반응이 일어나기 때문에 acetyl CoA가 먼저 결합하여 가수분해가 일어나서는 안되기 때문이다. 따라서 citryl CoA가 형성되어야만 구조적 변화가 일어나 물분자의 결합이 가능해진다. oxaloacetate가 citryl CoA로 전환되는 반응의 평형상수는 1에 가까우나 다음 단계에서 고에너지의 thioester 결합이 분해되면서 전체적인 자유에너지값의 변화는 큰 음수값을 가진다.

 

3. aconitase: 탈수와 재수화 반응에 의해 isocitrate로의 이성질화가 진행된다. 이 반응의 초점은 citrate는 탄소-탄소 결합이 끊어져야만 산화될 수 있는 3급 알코올이기 때문에 2급 알코올인 isocitrate로 전환시키는 것이다. 이 효소는 enolase와 fumarase와 동일한 기작의 효소반응을 촉매한다. 이 효소는 Fe/S cluster를 가진 갈색 단백질로서 iron-sulfur protein, 또는 nonheme iron protein 이라 불린다. 특기할 사항은 citrate는 prochiral 화합물로서 효소에 의해 pro-R arm에 있는 C-2의 pro-R 수소원자와 C-3의 OH를 떼어낸다. OH기를 떼어내는데 iron-sulfur cluster의 철이온이 중요한 역할을 한다. 이렇게 생성된 cis-aconitate에 다시 H와 OH가 반대로 전달되어 isocitrate를 형성한다.

 

4. isocitrate dehydrogenase: 산화적 탈카르복시화가 일어난다. isocitrate는 산화되면서 불안정한 β-ketoacid인 oxalosuccinate (실제로는 α-인 동시에 β-)로 전환되고, 이것은 효소와 결합한 상태에서 이산화탄소를 방출하면서 α-ketoglutarate로 전환된다. 효소의 활성자리에 결합된 Mn++는 ketocarbonyl 기를 극성화시킨다. (β-ketoacid는 carbonyl oxygen이 base로 작용하기 때문에 실온에서도 우발적인 탈카르복시화가 진행된다) 이 효소반응에서 생성되는 NADH는 바로 전자전달계와 연결되어 있다.

 

5. α-ketoglutarate dehydrogenase complex: pyruvate가 acetyl CoA로 전환되는 것과 매우 유사한 산화적 탈카르복시화가 일어난다. 실제로 이 효소복합체는 pyruvate dehydrogenase complex와 구조적으로 유사하다. 이 효소복합체를 구성하는 효소는 α-ketoglutarate dehydrogenase, dihydrolipoyl transsuccinylase, dihydrolipoyl dehydrogenase이다.

 

6. succinyl CoA synthetase: succinyl CoA는 고에너지 결합을 이루고 있어 이것의 분해는 GDP의 인산화와 연결되어 있다. 직접 고에너지 인산결합을 형성하는 TCA cycle 내의 유일한 결합이다. 이 효소반응에서는 CoA가 인산으로 치환되어 succinyl phosphate가 형성된 후 인산기는 활성자리의 His에 전달되고, succinate는 유리된다. 남아있는 인산기는 GDP에 전달되어 GTP가 생성된다.

 

7. succinate dehydrogenase: 이 효소는 미토콘드리아의 내막에 존재하는 내재성 막단백질로서 전자전달계의 복합체인 succinate-CoQ reductase의 일부분을 구성한다. 또한 Fe/S와 FAD가 공유결합되어 있는 iron-sulfur 단백질이다. 전자는 FAD에서 iron-sulfur cluster로 다시 CoQ를 통해 전자전달계로 전달된다.

 

8. fumarase: 물분자의 H와 OH를 입체특이적으로 전달한다.

 

9. malate dehydrogenase: 회로의 마지막 단계로서 malate가 oxaloacetate로 산화된다. 이 반응의 표준자유에너지 값은 큰 양의 값을 가진다. 때문에 미토콘드리아 내의 oxaloacetate의 농도는 매우 낮게 유지된다. 이 효소는 기능적으로 lactate dehydrogenase와 매우 유사하다. 실제로 두 효소는 유사한 입체구조를 가진다.

 

다. Anaplerotic reaction (보충대사반응)

α-ketoglutarate와 oxaloacetate는 아미노산 생합성의 전구체로서 이용되고, succinyl CoA는 porpyrin 생합성의 전구체로서 이용된다. 이와같이 생합성 전구물질을 제공한다는 측면에서 TCA 회로 내의 중간생성물들이 빠져나가면 그 공백을 어떻게 메울 것인가?

포유동물에서는 pyruvate carboxylase가 중요하다. 이것은 식물에는 존재하지 않는다. 4량체로 존재하며 biotin과 Mg++를 각 단위체에 가지고 있다. Acetyl CoA에 의해 절대적인 다른자리 입체성조절을 받는다. Acetyl CoA의 농도가 oxaloacetate 보다 높으면 활성화되어 pyruvate로부터 oxaloacetate의 합성이 증가되어 Acetyl CoA는 TCA 회로로 들어가게 된다.

효모, 세균, 고등식물에서는 phosphenolpyruvate carboxylase (PEP carboxylase)가 중요하다. 이것은 동물에는 존재하지 않는다. 이 효소는 oxaloacetate에서 생성되는 aspartate에 의해 특이적으로 저해된다.

Pyruvate로부터 malate를 합성하는 malic enzyme도 존재한다. 이것은 많은 동식물의 세포질이나 미토콘드리아에서 발견된다.

세균과 식물의 경우는 두가지 추가적인 효소 (isocitrate lyase, malate synthase)가 관여하는 glyoxylate 회로가 중요하다. 이것은 지방산을 분해하여 acetyl CoA를 만드는 식물종자의 glyoxysome에서 중요한 회로이다.

 

라. TCA 회로의 조절

이 회로의 조절은 ATP와 생합성전구체들의 적절한 공급 측면에서 매우 중요하다. 이 회로의 각 단계에 대한 자유에너지값의 변화를 참고하면 citrate synthase, isocitrate dehydrogenase, α-ketoglutarate dehydrogenase complex 3가지 효소에 의한 반응이 중요한 조절부위임을 알 수 있다.또한 acetyl CoA의 생성에 관여하는 pyruvate dehydrogenase complex도 중요한 조절부위이다.

이들 효소들은 substrate availability, product inhibition, competitive feedback inhibition by intermediates에 의해 조절된다. 이와 같이 단순해보이는 조절기작이 이루어지는 이유는 아마도 미토콘드리아라는 제한된 영역과 사이클을 구성하는 회로의 특성에 기인하는 것으로 보인다.  주요한 조절신호로는 acetyl CoA, ATP, NAD+의 농도가 중요하다. ATP와 NADH는 위의 세가지 효소에 대해 저해작용을 한다. 이때 중요한 것은 ADP/ATP와 NAD+/NADH의 농도비이다. Acetyl CoA는 활성인자로서 작용한다. Succinyl CoA도 조절역할을 한다. 이것은 citrate synthase와 α-ketoglutarate dehydrogenase를 저해한다.

 

Pyruvate dehydrogenase complex: 동물의 경우는 acetyl CoA로부터 글루코오즈의 합성이 불가능하다. 따라서 acetyl CoA로의 전환을 촉매하는 pyruvate dehydrogenase complex의 활성조절은 매우 중요하다. 포유동물의 경우 이 효소의 활성은 인산화와 탈인산화에 의해서도 조절된다. pyruvate dehydrogenase kinase는 pyruvate dehydrogenase와 결합되어 있으며, 이 kinase는 NADH와 acetyl CoA에 의해 다른자리 입체성조절로 활성화된다. 이러한 공유결합성 변형의 역반응은 pyruvate dehydrogenase phosphatase에 의해 촉매된다. 이 효소는 Ca2+에 의해 활성화되며, NADH/NAD의 농도비와 acetyl CoA의 농도가 낮을 경우 활성화되어 pyruvate dehydrogenase의 인산기를 떼어낸다 (칼슘이온은 근육수축의 신호로서 근육활동에 필요한 ATP의 요구를 의미한다).

 

Isocitrate dehydrogenase: 포유동물의 효소는 ADP와 NAD+에 의한 다른자리 입체성 활성화만이 일어난다. 반면 대장균의 효소는 공유결합성변형에 의해 조절된다. 단백질 인산화효소에 의해 인산화되면 활성은 저해되고, 가수분해효소의 작용으로 활성은 회복된다. 인산화효소는 TCA 회로와 해당과정의 중간체들 (isocitrate, 3-phosphoglycerate, pyruvate, PEP, oxaloacetate)이 많을 때 저해되는 반면 탈인산효소는 활성화된다. 이 효소반응이 TCA 회로의 분기점이 아님에도 불구하고 효소반응이 조절된다는 것은 다소 의외이다. 하지만 citrate/isocitrate의 비는 세포질 내의 acetyl CoA 생성속도를 조절한다.  그 이유는 세포질 내의 acetyl CoA는 미토콘드리아로부터 전달되는 citrate에 의존하기 때문이다. 따라서 미토콘드리아에서 이 효소의 활성은 세포질 내에서 acetyl CoA의 동화적인 이용에 우선하여 분해적인 TCA 회로에 이용되어야만 한다. 이러한 이유 때문에 세포내 소기관이 없는 대장균에서는 이 효소의 활성조절이 더욱 정교하게 조절되는 것으로 추정된다.

 

α-ketoglutarate dehydrogenase complex: succinyl CoA와 NADH에 의해 저해되며, 칼슘이온에 의해 활성화된다. α-ketoglutarate는 glutamate로 전환되어 이용되는 중요한 생합성 전구체이다. 따라서 에너지 상태에 따라 α-ketoglutarate의 용도가 결정되기 때문에 이 효소활성의 조절은 매우 중요하다.

 

***Cahn, Ingold, Prelog의 R & S Absolute Configuration

R은 rectus, S는 sinister에서 유래된 것으로 시계방향 회전과 반대방향 회전을 의미한다. 비대칭 탄소의 경우 4개의 치환기들에 우선순위를 매기고 우선순위가 가장 작은 것을 보는 입장에서 먼 쪽을 향하도록 배열한다. 그러면 나머지 3개의 치환기들은 평면상에 배열되는데 이때 우선순위가 시계방향으로 배열되면 R configuration을 가지고, 반대방향이면 S configuration을 가지는 것이다. (우선순위에 대한 내용은 유기화학 책을 참고한다)

 

Prochiral: 4개의 치환기 중 두 개의 치환기가 같으면 이 두 개 중 어느 하나의 우선순위를 높다고 가정하였을 때의 배열에 따라 Pro-R 또는 Pro-S를 명명할 수 있다.

 

Re or Si face: 3개의 치환기를 가진 탄소도 prochiral이 될 수 있다. 3개의 치환기가 이루는 평면에서 우선순위를 결정하였을 때 시계방향 면은 re face이며, 반대면은 si face에 해당된다.